本文關(guān)鍵詞：家族性甲狀腺乳頭狀癌及甲狀旁腺細(xì)胞系建立的相關(guān)研究

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【摘要】：目的:建立家族性甲狀腺乳頭狀癌(FPTC)永生化細(xì)胞系,為研究家族性非髓樣甲狀腺癌(FNMTC)提供新的途徑;建立甲狀旁腺(Parathyroid Gland)細(xì)胞系并進(jìn)行微囊化,為甲狀旁腺移植提供新的途徑。方法:選取FPTC患者的腫瘤標(biāo)本,采用消化法分離原代細(xì)胞;使用改良的DMEM/F12培養(yǎng)基,添加促甲狀腺激素(TSH)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)及氫化可的松等因子進(jìn)行培養(yǎng);在原代細(xì)胞早期分兩種方式導(dǎo)入外源基因猿猴病毒40大T抗原(SV40T)/端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)用于誘導(dǎo)永生化;利用RT-PCR檢測(cè)甲狀腺過氧化物酶(TPO)、甲狀腺球蛋白(TG)、促甲狀腺激素受體(TSHR)、鈉/碘共同轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)等基因的表達(dá),同時(shí)利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)TPO及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)蛋白的表達(dá);提取該患者外周血DNA,進(jìn)行突變基因的檢測(cè);提取細(xì)胞及腫瘤組織基因組PCR擴(kuò)增后測(cè)序,進(jìn)行突變基因的檢測(cè)。選取甲狀旁腺腺瘤患者的腫瘤標(biāo)本,采用消化法分離細(xì)胞;使用RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后,進(jìn)行微囊化,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及微囊的穩(wěn)定性;培養(yǎng)中多次檢測(cè)甲狀旁腺激素(PTH)等因子的水平。結(jié)果:分離的FPTC原代細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則多角形貼壁生長(zhǎng);細(xì)胞生長(zhǎng)6個(gè)月,轉(zhuǎn)染SV40T組(標(biāo)記為FPTC-S)傳代至p26,FPTC細(xì)胞傳代至p23,轉(zhuǎn)染SV40T+TERT組(標(biāo)記為FPTC-ST)傳代至p19,細(xì)胞增殖能力較好;FPTC-S與FPTC-ST細(xì)胞均能夠在基因水平穩(wěn)定表達(dá)TPO、TG與TSHR;患者外周血中存在MLH1 R217C胚系突變;原代細(xì)胞及部分腫瘤組織中存在BRAF V600E突變;原代細(xì)胞及永生化的細(xì)胞系中均存在MLH1 R217C基因突變。分離的甲狀旁腺腺瘤原代細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈兩種形態(tài),一種為圓形細(xì)胞,倒置顯微鏡下可見黃色熒光;另一種為短梭形細(xì)胞,散在分布于圓形細(xì)胞中,其形態(tài)分別與甲狀旁腺的主細(xì)胞及嗜酸細(xì)胞相近,細(xì)胞可以穩(wěn)定傳代至p15代;微囊化后,細(xì)胞可正常生長(zhǎng),并且沒有破壞微囊結(jié)構(gòu)。結(jié)論:本研究初步建立了FPTC永生化細(xì)胞系,且該細(xì)胞系中存在MLH1 R217C及BRAF V600E突變,該細(xì)胞系將為研究以上突變及其相互作用關(guān)系提供研究模型;同時(shí),本研究初步探索了甲狀旁腺腺瘤組織的分離及培養(yǎng)方法,并進(jìn)行了微囊化實(shí)驗(yàn),為甲狀旁腺移植提供了新的研究方法。
【關(guān)鍵詞】：家族性甲狀腺乳頭狀癌 甲狀旁腺功能低下 細(xì)胞系 原代培養(yǎng) MLH1 BRAF 微囊化 甲狀旁腺激素
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R736.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號(hào)說明10-12
• 前言12-15
• 研究現(xiàn)狀、成果12-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、家族性甲狀腺乳頭狀癌永生化細(xì)胞系的建立及鑒定15-45
• 1.1 對(duì)象和方法15-34
• 1.1.1 研究對(duì)象15
• 1.1.2 材料15-20
• 1.1.3 方法20-34
• 1.2 結(jié)果34-40
• 1.2.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況34-36
• 1.2.2 原代細(xì)胞永生化細(xì)胞系的建立36-38
• 1.2.3 細(xì)胞的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)檢測(cè)38
• 1.2.4 突變基因檢測(cè)結(jié)果38-40
• 1.3 討論40-44
• 1.3.1 原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng)40
• 1.3.2 永生化細(xì)胞系的建立40-41
• 1.3.3 細(xì)胞系中的基因突變41-44
• 1.4 小結(jié)44-45
• 二、甲狀旁腺細(xì)胞系建立及微囊化移植的初步研究45-54
• 2.1 對(duì)象和方法45-48
• 2.1.1 研究對(duì)象45
• 2.1.2 試劑與儀器45-46
• 2.1.3 方法46-48
• 2.2 結(jié)果48-51
• 2.2.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)生長(zhǎng)情況48-49
• 2.2.2 細(xì)胞微囊化實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-50
• 2.2.3 甲狀旁腺激素的測(cè)定結(jié)果50-51
• 2.3 討論51-53
• 2.3.1 原代細(xì)胞的分離及培養(yǎng)51
• 2.3.2 甲狀旁腺細(xì)胞的微囊化51-52
• 2.3.3 甲狀旁腺素的測(cè)定52-53
• 2.4 小結(jié)53-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明60-61
• 綜述 家族性甲狀腺乳頭狀癌及人甲狀腺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究進(jìn)展61-71
• 綜述參考文獻(xiàn)66-71
• 致謝71-72
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷72

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