本文關鍵詞：PSMD4在肝癌細胞中的表達及作用的研究

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【摘要】：目的:肝細胞癌(hepatocellμlar carcinoma,HCC)是一種進展速度很快的惡性腫瘤,在惡性腫瘤死因中占第3位。盡管手術治療和肝移植是目前治療肝癌的第一選擇,但是也只適用于15%-25%的病人,絕大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤的復發(fā)和轉移。目前第二可行的治療方案還是化學療法,不幸的是由于化療所帶來的毒性導致治療效果并不理想。因此,探索研究新的基因功能改變與肝細胞癌發(fā)生發(fā)展及其惡性特征的關系,對揭示其發(fā)生發(fā)展的分子機制、設計合理的治療方案及判斷預后有重要的意義。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system)被認為是一條重要的蛋白質降解途徑,該系統(tǒng)在細胞周期,細胞分化與細胞凋亡等生物學行為中起重要的調節(jié)作用。26S蛋白酶體是該系統(tǒng)的主要組成部分,由2個19S和1個20S亞單位組成的桶狀結構,20S為催化亞單位,19S為調節(jié)亞單位具有一種去泛素化的同功肽酶,使底物去泛素化而導致蛋白質的降解。PSMD4(Proteasome 26S subunit,non.ATPase)基因編碼的蛋白是人26S蛋白酶體非ATP酶亞基4,內在的子單元19S為調節(jié)亞單位可以綁定泛素而參與底物識別,從而導致目標蛋白質的選擇性降解。然而,PSMD4的表達與肝癌之間的關系尚不清楚。本研究的目的是利用臨床標本和細胞模型,探測PSMD4在人類肝癌組織中的表達情況,以及對肝癌細胞惡性表型的影響。從而為PSMD4是否可以代表一個有價值的肝癌標記物和治療靶點提供依據(jù)。方法:通過Real-time PCR和免疫組織化學方法檢測PSMD4在肝癌組織的表達;細胞免疫熒光染色分析檢測PSMD4的表達量;轉染靶向PSMD4的sh RNA敲低內源性PSMD4表達;檢測KLF4蛋白表達MTT和集落形成分析PSMD4對細胞生長的影響;通過沉默表達PSMD4的細胞模型檢測其在體外的致瘤性。結果:1抗體的測試及PSMD4在肝癌細胞內的亞定位首先我們構建了兩種質粒DNA,并且通過質粒瞬時轉染后用western方法檢測到PSMD4蛋白都有不同程度的過表達,證明構建的PSMD4質粒很成功,也驗證了PSMD4的抗體效能很好。然后我們用免疫熒光的方法檢測PSMD4的表達在細胞中的定位。PSMD4原始表達主要集中在細胞核和細胞質中,而過表達的PSMD4則主要集中在了細胞核中。2在臨床肝癌樣本中PSMD4的表達上調為了檢測PSMD4在肝癌中的表達情況,同過Real-time PCR的方法,檢測了PSMD4 m RNA的表達情況。按病理分期分成了四組,相對正常組,肝硬化組,高分化組和低分化組。結果顯示,PSMD4在肝癌組中的表達高于相對正常組和肝硬化組,而相對于正常組與肝硬化組,高分化組和低分化組之間沒有統(tǒng)計學差異。我們進一步檢測了PSMD4在蛋白質水平上的表達,Western結果顯示在隨即檢測的8組樣本中有75%肝癌樣本明顯高于相對應的癌旁組織。此外,免疫組化的結果顯示PSMD4在肝癌區(qū)域的表達高于旁邊的高分化或相對正常區(qū)域。3過表達PSMD4促進肝癌細胞克隆的形成為了深入研究PSMD4在肝癌中的生物學作用,通過Western的方法檢測了PSMD4在肝癌細胞系中的表達。結果顯示,幾乎所有的肝癌細胞系中PSMD4都呈高表達的狀態(tài)。為進一步探究過表達PSMD4是否調節(jié)腫瘤細胞的生長,我們在HLK3中建立了PSMD4穩(wěn)定過表達的細胞系和空載體對照組。然后檢測了PSMD4對克隆形成能力的影響。在HLK3細胞系中,分別轉染PSMD4質粒和相對照的空質粒,經(jīng)過兩周的G418藥物的篩選,結果顯示,PSMD4組的克隆形成在數(shù)量及大小上明顯多于對照組,并且結果具有顯著性差異(P0.05)。在SH-J1中的驗證也得到了相同的結果。以上的結果表明,過表達PSMD4可以增強肝癌細胞克隆形成的能力。4沉默PSMD4抑制體外腫瘤的形成通過構建shRNA干擾PSMD4的慢病毒,并建立了干擾PSMD4及對照的肝癌細胞系(SK-Hep1和Huh7)。MTT增殖實驗檢測了穩(wěn)定干擾PSMD4表達的SK-Hep1和Huh7兩個肝癌細胞系后,與對照細胞系相比,干擾組的細胞增殖受到了明顯的抑制。進一步檢測穩(wěn)定干擾PSMD4表達后對肝癌惡性生物學行為的影響。結果顯示,在干擾PSMD4之后,克隆的形成能力明顯受到了抑制。軟瓊脂克隆形成實驗顯示,干擾組細胞的體外成瘤形成能力受到了顯著的抑制。以上結果提示,PSMD4影響了肝癌細胞在體外的增殖和克隆形成的能力。結論:1抗體的測試及PSMD4在肝癌細胞內的亞定位。2在臨床肝癌樣本中PSMD4的表達上調。3過表達PSMD4促進肝癌細胞克隆的形成。4沉默PSMD4抑制體外腫瘤的形成。
【關鍵詞】：PSMD4 肝細胞癌 腫瘤生長 致瘤性
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-23
• 結果23-26
• 附圖26-31
• 討論31-32
• 結論32
• 參考文獻32-35
• 綜述 26S蛋白酶體復合物的功能概述35-41
• 參考文獻37-41
• 致謝41-42
• 個人簡歷42

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1 馮海斌;PSMD4在肝癌細胞中的表達及作用的研究[D];河北醫(yī)科大學;2015年

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本文編號：860125