本文關(guān)鍵詞：人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞PL45的核酸適配體篩選及其靶標(biāo)鑒定

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【摘要】：胰腺癌是一種惡性程度很高,診斷和治療都很困難的消化腺惡性腫瘤,是目前最嚴(yán)重的癌癥之一,病理類型包括導(dǎo)管腺癌、腺泡細(xì)胞癌、小腺體癌、大嗜酸性顆粒細(xì)胞性癌等,其中胰腺導(dǎo)管腺癌是胰腺癌中最常見的一種,占胰腺癌發(fā)病率的95%,往往晚期時才被發(fā)現(xiàn)。目前胰腺癌最有效的治療手段是手術(shù)切除,但是5年生存率仍不足6%,因此發(fā)現(xiàn)新的檢測胰腺癌特異性的分子探針,尋找新的腫瘤標(biāo)志物,對于胰腺癌的防治具有重要的作用。為了獲得特異性識別胰腺導(dǎo)管腺癌的核酸適配體,我們合成了ssDNA文庫,以人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PL45為靶標(biāo)細(xì)胞,以人永生化胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系hTERT-HPNE為對照細(xì)胞,進(jìn)行cell-SELEX篩選。通過15輪篩選,發(fā)現(xiàn)ssDNA庫達(dá)到最大富集。利用高通量測序技術(shù),根據(jù)序列的同質(zhì)性,分成了六個家族,挑選了每個家族的第一條用于進(jìn)一步的鑒定,發(fā)現(xiàn)XQ-2能特異性結(jié)合人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PL45,而不結(jié)合對照細(xì)胞系hTERT-HPNE,結(jié)合人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PL45的解離常數(shù)約為82.5nM。通過逐漸刪減兩端固定序列的方式對篩選出的核酸適配體XQ-2的序列進(jìn)行分析優(yōu)化,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明經(jīng)過刪減后的核酸適配體XQ-2d與靶細(xì)胞PL45的結(jié)合能力更強(qiáng)。為了提高核酸適配體在復(fù)雜環(huán)境中的穩(wěn)定性,對刪減后的核酸適配體XQ-2d進(jìn)行了化學(xué)修飾,發(fā)現(xiàn)經(jīng)甲氧基修飾的刪減后的核酸適配體,不僅保持了與靶細(xì)胞高效的結(jié)合能力,還可以明顯提高其穩(wěn)定性,這有利于其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。為了考察核酸適配體在復(fù)雜生物環(huán)境下的識別性能,本文表征了核酸適配體與臨床病理石蠟組織切片以及小鼠活體腫瘤的結(jié)合情況,切片結(jié)果表明核酸適配體對癌組織的識別效率高達(dá)82.5%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對正常組織的識別。在小鼠活體腫瘤實(shí)驗(yàn)中,尾靜脈注射5分鐘后,在腫瘤位置開始富集,60分鐘后富集達(dá)到最強(qiáng),180分鐘后腫瘤位置仍有信號,表明核酸適配體在復(fù)雜環(huán)境中仍能保持良好的識別能力,并且保持高度的組織特異性。目前胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤標(biāo)志物較少,無特異性,且用途不廣,十分有必要發(fā)現(xiàn)胰腺導(dǎo)管腺癌新的腫瘤標(biāo)志物十分有必要,本文利用生物質(zhì)譜、siRNA干擾技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、SDS-PAGE、western blot等技術(shù)成功發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了核酸適配體的靶標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1,利用核酸適配體與其靶標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1特異性結(jié)合的特性,發(fā)現(xiàn)的這種蛋白質(zhì)有望作為胰腺導(dǎo)管腺癌新的腫瘤標(biāo)志物,為胰腺導(dǎo)管腺癌的治療提供了新的方法和思路。
【關(guān)鍵詞】：核酸適配體 cell-SELEX 人胰腺導(dǎo)管腺癌 PL45 靶蛋白
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文縮寫對照9-13
• 第1章 緒論13-21
• 1.1 核酸適配體與SELEX13-16
• 1.1.1 核酸適配體13-14
• 1.1.2 SELEX14-16
• 1.2 核酸適配體在腫瘤研究中的應(yīng)用16-19
• 1.2.1 核酸適配體與腫瘤的靶向治療16-18
• 1.2.2 核酸適配體在腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與檢測中的應(yīng)用18-19
• 1.3 本論文開展的工作19-21
• 1.3.1 基于cell-SELEX篩選人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞PL45的核酸適配體19
• 1.3.2 人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PL45核酸適配體靶標(biāo)的尋找與鑒定19-21
• 第2章 基于cell-SELEX篩選人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PL45的核酸適配體21-35
• 2.1 前言21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分22-30
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)中用到的試劑、核酸序列、細(xì)胞系及儀器22-24
• 2.2.2 設(shè)計文庫與引物24-25
• 2.2.3 優(yōu)化PCR程序中的退火溫度25
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)中用到的細(xì)胞系及其培養(yǎng)25-26
• 2.2.5 細(xì)胞和文庫的準(zhǔn)備26
• 2.2.6 正向篩選26-27
• 2.2.7 反向篩選27-28
• 2.2.8 制備ssDNA文庫28
• 2.2.9 篩選過程中篩選壓力的調(diào)整及循環(huán)篩選28-29
• 2.2.10 檢測篩選進(jìn)程29-30
• 2.2.11 高通量測序30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 2.3.1 PCR退火溫度的優(yōu)化30-31
• 2.3.2 篩選文庫的富集31
• 2.3.3 富集文庫的高通量測序及核酸適配體的明確31-33
• 2.3.4 XQ-2與不同細(xì)胞系結(jié)合能力的分析33-34
• 2.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)34-35
• 第3章 XQ-2序列的優(yōu)化修飾及初步應(yīng)用35-49
• 3.1 前言35
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分35-42
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)中用到的核酸序列、儀器和試劑35-37
• 3.2.2 XQ-2序列的刪減優(yōu)化37-38
• 3.2.3 核酸適配體親和力的考察38
• 3.2.4 核酸適配體的競爭性考察38-40
• 3.2.5 溫度對XQ-2d與PL45細(xì)胞結(jié)合能力的影響40
• 3.2.6 核酸適配體穩(wěn)定性的考察40-41
• 3.2.7 核酸適配體在臨床病理組織切片中的檢測41-42
• 3.2.8 核酸適配體在活體胰腺癌移植瘤中的成像42
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-48
• 3.3.1 XQ-2序列的優(yōu)化42-43
• 3.3.2 核酸適配體的特點(diǎn)43-46
• 3.3.3 核酸適配體在組織切片與腫瘤活體成像中的應(yīng)用46-48
• 3.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)48-49
• 第4章 XQ-2d結(jié)合人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PL45的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)49-59
• 4.1 前言49-50
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分50-55
• 4.2.1 核酸序列、試劑儀器與溶液配制50-52
• 4.2.2 XQ-2d的靶標(biāo)類型52-53
• 4.2.3 收集膜蛋白樣品53
• 4.2.4 蛋白上樣樣品的制備53-54
• 4.2.5 SDS-PAGE電泳54-55
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-57
• 4.3.1 XQ-2d的靶標(biāo)類型分析55
• 4.3.2 5'-T(6)-XQ-2d與PL45細(xì)胞結(jié)合的能力分析55-56
• 4.3.3 質(zhì)譜鑒定XQ-2d結(jié)合的蛋白質(zhì)56-57
• 4.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)57-59
• 第5章 XQ-2d結(jié)合胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系PL45的靶標(biāo)鑒定59-72
• 5.1 前言59
• 5.2 實(shí)驗(yàn)部分59-67
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)中所用到的儀器試劑以及核酸序列與溶液配制59-60
• 5.2.2 XQ-2d-pull down實(shí)驗(yàn)60-61
• 5.2.3 驗(yàn)證4條干擾序列的干擾效果61-63
• 5.2.4 檢測XQ-2d與有效干擾之后的PL45細(xì)胞的結(jié)合63-64
• 5.2.5 XQ-2d與CD71蛋白的共定位64-65
• 5.2.6 抗體的Kd值,抗體與XQ-2d的競爭性分析65-67
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-71
• 5.3.1 XQ-2d與CD71蛋白在人胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞PL45的定位分析67
• 5.3.2 Aptamer-pull down檢測XQ-2d結(jié)合的蛋白是CD71蛋白67-68
• 5.3.3 干擾實(shí)驗(yàn)68-69
• 5.3.4 XQ-2d與CD71抗體的競爭分析69-71
• 5.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)71-72
• 結(jié)論72-73
• 參考文獻(xiàn)73-80
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄80-81
• 致謝81-82

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本文編號：849638