本文關鍵詞：低氧下cyclinB1表達與肝癌細胞對Hsp90抑制劑17-DMAG耐藥性的關系探討

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【摘要】：研究背景腫瘤發(fā)生的生物學基礎是細胞增殖失去調(diào)控,通常是具有生長潛能的細胞受到物理、化學、生物等各種致癌因素作用后,細胞內(nèi)的原癌基因被激活,細胞獲得持續(xù)增殖能力程序性凋亡功能發(fā)生障礙。腫瘤發(fā)生后,腫瘤細胞獲得持續(xù)增殖的能力,腫瘤組織快速增殖,在其快速增殖過程中,由于血管的增長速度趕不上瘤體的增殖速度,瘤體內(nèi)部會出現(xiàn)血液供應不足的情況,進而造成瘤體內(nèi)部氧氣供應不足,產(chǎn)生低氧(Hypoxia)。低氧是包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種固體腫瘤的典型特征之一,是指可利用氧的減少或氧分壓降至臨界值以下的狀態(tài),這種狀態(tài)會限制,甚至終止器官、組織和細胞的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)低氧微環(huán)境使腫瘤對放療、化療和手術治療的療效明顯下降。其可能的機制是氧氣被激發(fā)產(chǎn)生自由基,而氧自由基可以殺傷靶細胞,從而達到殺死腫瘤細胞的目的。但是,腫瘤低氧區(qū)的細胞由于缺乏氧氣而產(chǎn)生較少的自由基,往往會對治療產(chǎn)生抵抗。與常氧區(qū)比起來,低氧區(qū)的腫瘤細胞可以在放療后存活并繼續(xù)增殖。隨著研究的深入,腫瘤低氧對其自身的影響遠遠不只是對放療的抵抗作用,而遍及細胞的各個領域。機體通過細胞內(nèi)Heme、氧化還原狀態(tài)、線粒體的ROS感受外界氧信號變化,通過NO、CO等氣體信號分子、KATP等離子通道、細胞內(nèi)游離鈣、環(huán)核苷酸、PKC、MAPK等應激相關信號通路,調(diào)節(jié)線粒體編碼的部分呼吸酶亞基與核編碼的亞基的協(xié)同表達,改變能量的產(chǎn)生和利用。已知間歇性低氧預適應可增強熱休克蛋白類及抗氧化酶系表達,調(diào)控線粒體中的基因表達,抑制細胞內(nèi)鈣超載、影響細胞核膜的鈣轉(zhuǎn)運,提高葡萄糖轉(zhuǎn)運能力,激活低氧相關信號轉(zhuǎn)導通路。熱休克蛋白(Heat shock protein, Hsps)是一類蛋白質(zhì)超家族,Hsp90是其中最重要的一種。Hsp90在生物進化過程中高度保守,在細胞內(nèi)有著舉足輕重的作用,當前研究發(fā)現(xiàn)的其作用底物已超過200種蛋白。同樣越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與治療亦涉及到機體的各個方面,但當前治療藥物大多是針對單一信號通路,治療效果不理想,而聯(lián)合用藥導致治療復雜化及更多的副作用,因此作用于多個信號通路的藥物具有良好的應用前景。Hsp90就是多個信號通路的分子靶點,亦有多項研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中呈高表達,是腫瘤治療研究中潛在重要靶點。自從第一個具有抗腫瘤活性的Hsp90抑制劑格爾德霉素被發(fā)現(xiàn)以來,美國國家腫瘤中心(Bethesda,MD,USA)研究針對Hsp90靶點治療藥物已經(jīng)進行了20多年。到目前為止已經(jīng)有多種具有抗腫瘤活性的Hsp90抑制劑被發(fā)現(xiàn),其中有的具有良好的效果而進入了Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗,如：格爾德霉素(geldanamycin)、17-AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin)-.17-DMAG (17- Dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin)等。尤其格爾德霉素衍生物17-DMAG因其良好抗腫瘤作用、更好的水溶性和抗腫瘤活性,成成為一個具有良好的應用前景的抗腫瘤藥物。細胞周期蛋白cyclinB1就是Hsp90眾多的底物蛋白之一,是細胞G2/M期的關鍵蛋白,控制著細胞由G2期進入M期。在正常哺乳動物細胞中,細胞周期進程中存在著避免細胞DNA和蛋白復制過程出現(xiàn)錯誤的G1期和G2期兩個重要的細胞周期檢查點,但在腫瘤細胞中普遍存在G1期檢查點缺陷,進而在腫瘤細胞分裂進程中,腫瘤細胞趨向依賴G2期細胞周期檢查點去避免腫瘤細胞的致死性分裂,腫瘤細胞G2期細胞周期檢查點成為了腫瘤靶向治療當中的誘人靶點。cyclinB1作為G2/M期的關鍵蛋白,其在腫瘤的治療、預后等都起著很重要的作用。當前已有多種研究證實,cyclinB1在胃癌、食管癌等多種腫瘤中異常表達。亦有研究證實cyclinB1的表達高低對腫瘤的治療有明顯的相關性,研究結(jié)果顯示,cyclinB1的高表達有利于腫瘤的治療,盡管其具體機制尚未明確,但其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預后表現(xiàn)出的密切聯(lián)系日益受到關注。cyclinB1是Hsp90的作用底物之一,二者之間的具體作用關系尚未完全明確,但確定的是二者之間存在者千絲萬縷的關系。本課題組前期研究結(jié)果顯示Hsp90抑制劑17-DMAG可以增加cyclinB1的表達,亦有研究證實17-DMAG通過調(diào)節(jié)cdc2蛋白誘導細胞G2/M期阻滯,而調(diào)節(jié)cdc2的直接結(jié)果就是誘導cyclinB1蓄積進而導致周期阻滯,即基本明確的是17-DMAG誘導cyclinB1蓄積導致細胞G2/M期阻滯,進而誘導細胞凋亡。目前,有許多研究顯示,低氧可以降低腫瘤對藥物的敏感性,且發(fā)現(xiàn)低氧可誘導腫瘤細胞周期分布發(fā)生改變,導致細胞G2/M期減少。G2/M期減少意味著G2/M期蛋白cyclinB1的表達會發(fā)生變化,但在低氧狀態(tài)下cyclinB1的表達會發(fā)生何種變化及其具體的機制均有待進一步探討研究。由此,本研究通過物理低氧方法在體外建立肝癌細胞低氧模型,應用Hsp90抑制劑17-DMAG,觀察描述與常氧相比,低氧下17-DMAG對肝癌細胞的作用,以及cyclinB 1的表達變化,探討其變化與17-DMAG對肝癌細胞作用變化的相關關系及相應的作用機制。目的：1.建立肝癌細胞株低氧應激模型,研究在常氧和低氧培養(yǎng)狀態(tài)下,不同肝癌細胞株的增殖情況及其對細胞周期的影響。2.研究在常氧或低氧狀態(tài)下不同濃度的Hsp90抑制劑17-DMAG對肝癌細胞株的生長抑制情況、對細胞周期的影響。3.研究低氧和17-DMAG對細胞周期蛋白cyclinB1表達的影響,CyclinB1是否參與低氧降低腫瘤細胞對17-DMAG的敏感性及其具體機制。4.研究裸鼠荷瘤瘤體內(nèi)低氧區(qū)域cyclinB1的表達變化。方法：1.建立低氧應激模型：將HepG2和Huh7細胞分別于1%02的低氧下培養(yǎng)不同時間(Oh、24、48、72h), CCK-8比色法檢測各個時間點細胞增殖情況。Western-blot檢測細胞全蛋白HIF-1α,觀察低氧效應。2. HepG2和Huh7細胞分別于低氧下培養(yǎng)不同時間(0h、6h、12h、24h,48h),流式細胞術檢測不同時間的低氧對細胞周期的影響。3.HepG2和Huh7細胞于常氧或低氧培養(yǎng)狀態(tài)下用不同濃度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、l0μM)的Hsp90抑制劑17-DMAG分別處理24h和48h,用CCK-8比色法檢測細胞存活情況,流式細胞術檢測常氧或低氧狀態(tài)下不同濃度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、 1μM)17-DMAG對細胞周期的影響,Western-blot檢測相關周期蛋白表達情況。4.利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術建立cyclinB 1-mCherry穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,激光共聚焦顯微鏡連續(xù)觀察24h內(nèi)細胞內(nèi)cyclinB1蛋白的合成情況及其在細胞內(nèi)的定位。5.利用Real-time PCR技術檢測肝癌細胞株HepG2和Huh7細胞內(nèi)cyclinB1的RNA轉(zhuǎn)錄情況,利用免疫共沉淀(Co-IP)技術檢測cyclinB1被泛素蛋白標記情況。6.利用siRNA技術干擾肝癌細胞株HepG2的cyclinB1表達,將細胞分為對照組(NC組)和siRNA干擾組,于常氧培養(yǎng)并用不同濃度17-DMAG處理24h,CCK-8比色法檢測細胞存活情況。7.肝癌細胞株HepG2進行裸鼠荷瘤實驗,觀察17-DMAG對荷瘤瘤體生長的影響。通過免疫組化技術區(qū)別瘤體內(nèi)低氧與常氧區(qū),并檢測相應區(qū)域cyclinB1的表達情況。結(jié)果：1.1%的低氧處理后,細胞內(nèi)HIF-la表達明顯增多,達到預期低氧效果。且低氧明顯促進肝癌細胞株HepG2和Huh7增殖,不同濃度的17-DMAG處理肝癌細胞株HepG2和Huh7　24h后,與常氧組相比,低氧組細胞增殖毒性較低,細胞G2/M期阻滯程度較低,cyclinB1表達水平低。2.低氧條件下培養(yǎng)肝癌細胞株HepG2和Huh7不同的時間后,細胞周期出現(xiàn)G1/S期增多,G2/M期減少。低氧時間越久,G1/S期增多越明顯。低氧可以減輕17-DMAG誘導肝癌細胞株HepG2和Huh7 G2/M期阻滯。在常氧或低氧下17-DMAG均可誘導肝癌細胞株HepG2和Huh7凋亡。3.17-DMAG通過調(diào)節(jié)cdc2蛋白誘導細胞周期蛋白cyclinB1蓄積。與常氧組相比,低氧降低cyclinB1的表達,并增加經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑的降解。siRNA干擾cyclinB1的表達后,與正常對照組相比,17-DMAG對細胞的抑制率下降。4.17-DMAG能明顯抑制裸鼠荷瘤瘤體的生長,瘤體內(nèi)HIF-la表達高的區(qū)域,cyclinB1低表達。結(jié)論：1.在低氧應激模型建立過程中,研究結(jié)果顯示1%濃度的02可以明顯促進肝癌細胞株HepG2和Huh7增殖,并且誘導肝癌細胞株HepG2和Huh7細胞周期變化,導致G1/S期增多,G2/M期減少。2.不同濃度的17-DMAG在常氧或低氧狀態(tài)下處理肝癌細胞株HepG2和Huh7,與常氧狀態(tài)下比較,低氧可以降低肝癌細胞株G2/M的阻滯程度,也能夠降低肝癌細胞株對17-DMAG的敏感性。3.在低氧狀態(tài)下,肝癌細胞能夠通過降低cylinB1的轉(zhuǎn)錄水平,增加cyclinB1經(jīng)過蛋白酶體途徑降解速率減少17-DMAG誘導的cyclinB1蓄積,進而降低肝癌細胞對17-DMAG的敏感性。4.裸鼠荷瘤結(jié)果顯示,17-DMAG能明顯縮小瘤體體積,瘤體內(nèi)存在明顯的低氧區(qū)域,且在低氧區(qū)域cyclinB1轉(zhuǎn)錄水平降低。綜上可得：低氧能夠通過降低cyclinB1的表達和促進降解來降低肝癌細胞對Hsp90抑制劑17-DMAG的敏感性。
【關鍵詞】：低氧 HIF1α 熱休克蛋白 細胞周期 17-DMAG
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 材料和方法25-43
• 1. 實驗材料25-30
• 2. 實驗方法30-42
• 3. 統(tǒng)計學分析42-43
• 結(jié)果43-57
• 1. 低氧能促進肝癌細胞株HepG2、Huh7增殖并且降低對Hsp90的抑制劑17. DMAG的敏感性43-45
• 2. 低氧和17-DMAG對細胞周期和細胞凋亡的影響45-49
• 3. 低氧和17-DMAG對細胞周期相關蛋白和CyClinB1的影響49-54
• 4. 17. DMAG抑制肝癌細胞株裸鼠荷瘤生長及在荷瘤瘤體內(nèi)低氧也能抑制cyClinB1表達54-57
• 討論57-62
• 結(jié)論62-63
• 全文小結(jié)63-64
• 參考文獻64-71
• 發(fā)表論文71-72
• 致謝72-73

【共引文獻】

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