發(fā)布時間：2017-09-12 20:35

  本文關(guān)鍵詞：低氧下cyclinB1表達(dá)與肝癌細(xì)胞對Hsp90抑制劑17-DMAG耐藥性的關(guān)系探討

  更多相關(guān)文章： 低氧 HIF1α 熱休克蛋白 細(xì)胞周期 17-DMAG

【摘要】：研究背景腫瘤發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)是細(xì)胞增殖失去調(diào)控,通常是具有生長潛能的細(xì)胞受到物理、化學(xué)、生物等各種致癌因素作用后,細(xì)胞內(nèi)的原癌基因被激活,細(xì)胞獲得持續(xù)增殖能力程序性凋亡功能發(fā)生障礙。腫瘤發(fā)生后,腫瘤細(xì)胞獲得持續(xù)增殖的能力,腫瘤組織快速增殖,在其快速增殖過程中,由于血管的增長速度趕不上瘤體的增殖速度,瘤體內(nèi)部會出現(xiàn)血液供應(yīng)不足的情況,進(jìn)而造成瘤體內(nèi)部氧氣供應(yīng)不足,產(chǎn)生低氧(Hypoxia)。低氧是包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種固體腫瘤的典型特征之一,是指可利用氧的減少或氧分壓降至臨界值以下的狀態(tài),這種狀態(tài)會限制,甚至終止器官、組織和細(xì)胞的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)低氧微環(huán)境使腫瘤對放療、化療和手術(shù)治療的療效明顯下降。其可能的機(jī)制是氧氣被激發(fā)產(chǎn)生自由基,而氧自由基可以殺傷靶細(xì)胞,從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。但是,腫瘤低氧區(qū)的細(xì)胞由于缺乏氧氣而產(chǎn)生較少的自由基,往往會對治療產(chǎn)生抵抗。與常氧區(qū)比起來,低氧區(qū)的腫瘤細(xì)胞可以在放療后存活并繼續(xù)增殖。隨著研究的深入,腫瘤低氧對其自身的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)不只是對放療的抵抗作用,而遍及細(xì)胞的各個領(lǐng)域。機(jī)體通過細(xì)胞內(nèi)Heme、氧化還原狀態(tài)、線粒體的ROS感受外界氧信號變化,通過NO、CO等氣體信號分子、KATP等離子通道、細(xì)胞內(nèi)游離鈣、環(huán)核苷酸、PKC、MAPK等應(yīng)激相關(guān)信號通路,調(diào)節(jié)線粒體編碼的部分呼吸酶亞基與核編碼的亞基的協(xié)同表達(dá),改變能量的產(chǎn)生和利用。已知間歇性低氧預(yù)適應(yīng)可增強(qiáng)熱休克蛋白類及抗氧化酶系表達(dá),調(diào)控線粒體中的基因表達(dá),抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、影響細(xì)胞核膜的鈣轉(zhuǎn)運(yùn),提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力,激活低氧相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。熱休克蛋白(Heat shock protein, Hsps)是一類蛋白質(zhì)超家族,Hsp90是其中最重要的一種。Hsp90在生物進(jìn)化過程中高度保守,在細(xì)胞內(nèi)有著舉足輕重的作用,當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)的其作用底物已超過200種蛋白。同樣越來越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與治療亦涉及到機(jī)體的各個方面,但當(dāng)前治療藥物大多是針對單一信號通路,治療效果不理想,而聯(lián)合用藥導(dǎo)致治療復(fù)雜化及更多的副作用,因此作用于多個信號通路的藥物具有良好的應(yīng)用前景。Hsp90就是多個信號通路的分子靶點(diǎn),亦有多項研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中呈高表達(dá),是腫瘤治療研究中潛在重要靶點(diǎn)。自從第一個具有抗腫瘤活性的Hsp90抑制劑格爾德霉素被發(fā)現(xiàn)以來,美國國家腫瘤中心(Bethesda,MD,USA)研究針對Hsp90靶點(diǎn)治療藥物已經(jīng)進(jìn)行了20多年。到目前為止已經(jīng)有多種具有抗腫瘤活性的Hsp90抑制劑被發(fā)現(xiàn),其中有的具有良好的效果而進(jìn)入了Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗,如：格爾德霉素(geldanamycin)、17-AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin)-.17-DMAG (17- Dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin)等。尤其格爾德霉素衍生物17-DMAG因其良好抗腫瘤作用、更好的水溶性和抗腫瘤活性,成成為一個具有良好的應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。細(xì)胞周期蛋白cyclinB1就是Hsp90眾多的底物蛋白之一,是細(xì)胞G2/M期的關(guān)鍵蛋白,控制著細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期。在正常哺乳動物細(xì)胞中,細(xì)胞周期進(jìn)程中存在著避免細(xì)胞DNA和蛋白復(fù)制過程出現(xiàn)錯誤的G1期和G2期兩個重要的細(xì)胞周期檢查點(diǎn),但在腫瘤細(xì)胞中普遍存在G1期檢查點(diǎn)缺陷,進(jìn)而在腫瘤細(xì)胞分裂進(jìn)程中,腫瘤細(xì)胞趨向依賴G2期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)去避免腫瘤細(xì)胞的致死性分裂,腫瘤細(xì)胞G2期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)成為了腫瘤靶向治療當(dāng)中的誘人靶點(diǎn)。cyclinB1作為G2/M期的關(guān)鍵蛋白,其在腫瘤的治療、預(yù)后等都起著很重要的作用。當(dāng)前已有多種研究證實,cyclinB1在胃癌、食管癌等多種腫瘤中異常表達(dá)。亦有研究證實cyclinB1的表達(dá)高低對腫瘤的治療有明顯的相關(guān)性,研究結(jié)果顯示,cyclinB1的高表達(dá)有利于腫瘤的治療,盡管其具體機(jī)制尚未明確,但其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后表現(xiàn)出的密切聯(lián)系日益受到關(guān)注。cyclinB1是Hsp90的作用底物之一,二者之間的具體作用關(guān)系尚未完全明確,但確定的是二者之間存在者千絲萬縷的關(guān)系。本課題組前期研究結(jié)果顯示Hsp90抑制劑17-DMAG可以增加cyclinB1的表達(dá),亦有研究證實17-DMAG通過調(diào)節(jié)cdc2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯,而調(diào)節(jié)cdc2的直接結(jié)果就是誘導(dǎo)cyclinB1蓄積進(jìn)而導(dǎo)致周期阻滯,即基本明確的是17-DMAG誘導(dǎo)cyclinB1蓄積導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前,有許多研究顯示,低氧可以降低腫瘤對藥物的敏感性,且發(fā)現(xiàn)低氧可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期分布發(fā)生改變,導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期減少。G2/M期減少意味著G2/M期蛋白cyclinB1的表達(dá)會發(fā)生變化,但在低氧狀態(tài)下cyclinB1的表達(dá)會發(fā)生何種變化及其具體的機(jī)制均有待進(jìn)一步探討研究。由此,本研究通過物理低氧方法在體外建立肝癌細(xì)胞低氧模型,應(yīng)用Hsp90抑制劑17-DMAG,觀察描述與常氧相比,低氧下17-DMAG對肝癌細(xì)胞的作用,以及cyclinB 1的表達(dá)變化,探討其變化與17-DMAG對肝癌細(xì)胞作用變化的相關(guān)關(guān)系及相應(yīng)的作用機(jī)制。目的：1.建立肝癌細(xì)胞株低氧應(yīng)激模型,研究在常氧和低氧培養(yǎng)狀態(tài)下,不同肝癌細(xì)胞株的增殖情況及其對細(xì)胞周期的影響。2.研究在常氧或低氧狀態(tài)下不同濃度的Hsp90抑制劑17-DMAG對肝癌細(xì)胞株的生長抑制情況、對細(xì)胞周期的影響。3.研究低氧和17-DMAG對細(xì)胞周期蛋白cyclinB1表達(dá)的影響,CyclinB1是否參與低氧降低腫瘤細(xì)胞對17-DMAG的敏感性及其具體機(jī)制。4.研究裸鼠荷瘤瘤體內(nèi)低氧區(qū)域cyclinB1的表達(dá)變化。方法：1.建立低氧應(yīng)激模型：將HepG2和Huh7細(xì)胞分別于1%02的低氧下培養(yǎng)不同時間(Oh、24、48、72h), CCK-8比色法檢測各個時間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況。Western-blot檢測細(xì)胞全蛋白HIF-1α,觀察低氧效應(yīng)。2. HepG2和Huh7細(xì)胞分別于低氧下培養(yǎng)不同時間(0h、6h、12h、24h,48h),流式細(xì)胞術(shù)檢測不同時間的低氧對細(xì)胞周期的影響。3.HepG2和Huh7細(xì)胞于常氧或低氧培養(yǎng)狀態(tài)下用不同濃度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、l0μM)的Hsp90抑制劑17-DMAG分別處理24h和48h,用CCK-8比色法檢測細(xì)胞存活情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測常氧或低氧狀態(tài)下不同濃度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、 1μM)17-DMAG對細(xì)胞周期的影響,Western-blot檢測相關(guān)周期蛋白表達(dá)情況。4.利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)建立cyclinB 1-mCherry穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,激光共聚焦顯微鏡連續(xù)觀察24h內(nèi)細(xì)胞內(nèi)cyclinB1蛋白的合成情況及其在細(xì)胞內(nèi)的定位。5.利用Real-time PCR技術(shù)檢測肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7細(xì)胞內(nèi)cyclinB1的RNA轉(zhuǎn)錄情況,利用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)檢測cyclinB1被泛素蛋白標(biāo)記情況。6.利用siRNA技術(shù)干擾肝癌細(xì)胞株HepG2的cyclinB1表達(dá),將細(xì)胞分為對照組(NC組)和siRNA干擾組,于常氧培養(yǎng)并用不同濃度17-DMAG處理24h,CCK-8比色法檢測細(xì)胞存活情況。7.肝癌細(xì)胞株HepG2進(jìn)行裸鼠荷瘤實驗,觀察17-DMAG對荷瘤瘤體生長的影響。通過免疫組化技術(shù)區(qū)別瘤體內(nèi)低氧與常氧區(qū),并檢測相應(yīng)區(qū)域cyclinB1的表達(dá)情況。結(jié)果：1.1%的低氧處理后,細(xì)胞內(nèi)HIF-la表達(dá)明顯增多,達(dá)到預(yù)期低氧效果。且低氧明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7增殖,不同濃度的17-DMAG處理肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7　24h后,與常氧組相比,低氧組細(xì)胞增殖毒性較低,細(xì)胞G2/M期阻滯程度較低,cyclinB1表達(dá)水平低。2.低氧條件下培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7不同的時間后,細(xì)胞周期出現(xiàn)G1/S期增多,G2/M期減少。低氧時間越久,G1/S期增多越明顯。低氧可以減輕17-DMAG誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7 G2/M期阻滯。在常氧或低氧下17-DMAG均可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7凋亡。3.17-DMAG通過調(diào)節(jié)cdc2蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白cyclinB1蓄積。與常氧組相比,低氧降低cyclinB1的表達(dá),并增加經(jīng)過泛素-蛋白酶體途徑的降解。siRNA干擾cyclinB1的表達(dá)后,與正常對照組相比,17-DMAG對細(xì)胞的抑制率下降。4.17-DMAG能明顯抑制裸鼠荷瘤瘤體的生長,瘤體內(nèi)HIF-la表達(dá)高的區(qū)域,cyclinB1低表達(dá)。結(jié)論：1.在低氧應(yīng)激模型建立過程中,研究結(jié)果顯示1%濃度的02可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7增殖,并且誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7細(xì)胞周期變化,導(dǎo)致G1/S期增多,G2/M期減少。2.不同濃度的17-DMAG在常氧或低氧狀態(tài)下處理肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7,與常氧狀態(tài)下比較,低氧可以降低肝癌細(xì)胞株G2/M的阻滯程度,也能夠降低肝癌細(xì)胞株對17-DMAG的敏感性。3.在低氧狀態(tài)下,肝癌細(xì)胞能夠通過降低cylinB1的轉(zhuǎn)錄水平,增加cyclinB1經(jīng)過蛋白酶體途徑降解速率減少17-DMAG誘導(dǎo)的cyclinB1蓄積,進(jìn)而降低肝癌細(xì)胞對17-DMAG的敏感性。4.裸鼠荷瘤結(jié)果顯示,17-DMAG能明顯縮小瘤體體積,瘤體內(nèi)存在明顯的低氧區(qū)域,且在低氧區(qū)域cyclinB1轉(zhuǎn)錄水平降低。綜上可得：低氧能夠通過降低cyclinB1的表達(dá)和促進(jìn)降解來降低肝癌細(xì)胞對Hsp90抑制劑17-DMAG的敏感性。
【關(guān)鍵詞】：低氧 HIF1α 熱休克蛋白 細(xì)胞周期 17-DMAG
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-25
• 材料和方法25-43
• 1. 實驗材料25-30
• 2. 實驗方法30-42
• 3. 統(tǒng)計學(xué)分析42-43
• 結(jié)果43-57
• 1. 低氧能促進(jìn)肝癌細(xì)胞株HepG2、Huh7增殖并且降低對Hsp90的抑制劑17. DMAG的敏感性43-45
• 2. 低氧和17-DMAG對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響45-49
• 3. 低氧和17-DMAG對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和CyClinB1的影響49-54
• 4. 17. DMAG抑制肝癌細(xì)胞株裸鼠荷瘤生長及在荷瘤瘤體內(nèi)低氧也能抑制cyClinB1表達(dá)54-57
• 討論57-62
• 結(jié)論62-63
• 全文小結(jié)63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 發(fā)表論文71-72
• 致謝72-73

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：839397