本文關(guān)鍵詞：miR-21調(diào)節(jié)乳腺癌細胞增殖的DNA甲基化機制研究

  更多相關(guān)文章： 乳腺癌 微小RNA21 DNA甲基化 聯(lián)合作用 細胞增殖

【摘要】：目的微小RNA 21(miR-21)與DNA甲基化在乳腺癌發(fā)生過程中均發(fā)揮重要作用,與癌細胞增殖密切相關(guān)。然而二者在乳腺癌中的相互調(diào)節(jié)關(guān)系則知之甚少。因此本研究首先以探究乳腺癌細胞中miR-21與DNA甲基化的相互調(diào)節(jié)作用為切入點,進一步通過調(diào)節(jié)miR-21的表達及DNA甲基化水平研究二者在乳腺癌增殖中的聯(lián)合作用。方法以LV3為載體,病毒包裝miR-21抑制劑及其陰性對照序列感染MCF-7、MDA-MB-231細胞,使用熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效率及Real-time PCR檢測miR-21表達的抑制率,接以bisulfite-qMSP檢測基因組DNA甲基化水平,并以Real-time PCR及Western blot分別對DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的RNA和蛋白表達水平以及RAS通路中的重要分子H-RAS、RASGRP1進行檢測。反之,以2.5μM DNA甲基化酶抑制劑5-Aza處理細胞72小時,觀察DNA甲基化改變對miR-21表達水平的影響。以BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)法檢測miR-21抑制劑與5-Aza在乳腺癌細胞增殖中的聯(lián)合作用,并以流式細胞儀對細胞周期及細胞凋亡進行檢測。結(jié)果熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,LV3-AS-miR-21及LV3-NC均能有效感染細胞,LV3-AS-miR-21可顯著敲低細胞內(nèi)miR-21的表達水平(P0.05)。同時發(fā)現(xiàn),敲低miR-21表達,可顯著降低MCF-7(P0.05)細胞整體DNA甲基化水平,并引起轉(zhuǎn)錄水平上Dnmt1、Dnmt3a(P0.05)的升高及Dnmt3b的降低(P0.05)。而在MDA-MB-231細胞內(nèi)則發(fā)現(xiàn)其整體DNA甲基化水平有所升高(P0.05),同時伴隨有Dnmt1(P0.05)、Dnmt3a(P0.05)及Dnmt3b(P0.05)在RNA水平的表達升高。同時在對Dnmts蛋白水平的檢測中發(fā)現(xiàn),miR-21的低表達可引起MCF-7細胞內(nèi)Dnmt3b蛋白水平的明顯降低。相反的,其在MDA-MB-231細胞內(nèi)的表達則顯著升高。我們同時發(fā)現(xiàn),敲低miR-21的表達,可明顯降低MCF-7細胞內(nèi)RASGRP1(P0.01)的表達水平,而在MDA-MB-231細胞中則可顯著上調(diào)H-RAS(P0.01)及RASGRP1(P0.05)的表達水平。使用5-Aza處理細胞則發(fā)現(xiàn),其在顯著降低兩種細胞基因組DNA甲基化水平(P0.01)的同時,可有效上調(diào)miR-21的表達水平(P0.01)。BrdU檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲基化酶抑制劑5-Aza可協(xié)同miR-21抑制劑進一步抑制MCF-7細胞的增殖(P0.01);而在MDA-MB-231細胞中發(fā)現(xiàn),5-Aza的使用亦可進一步增強miR-21抑制劑對細胞增殖的抑制作用(P0.01)。進一步的細胞周期及凋亡檢測發(fā)現(xiàn),相對于單獨處理,5-Aza與miR-21抑制劑聯(lián)合使用可進一步加劇MCF-7細胞G1/S期阻滯并進一步降低周期調(diào)控蛋白Cyclin D1的蛋白表達水平。結(jié)論病毒介導的miR-21抑制劑對乳腺癌MCF-7與MDA-MB-231細胞DNA甲基化水平的調(diào)節(jié)截然相反,其中Dnmt3b發(fā)揮主要作用。這一過程可能有RAS信號通路的參與。而DNA甲基化的降低則可使兩種細胞內(nèi)miR-21的表達一致上調(diào)。與各自單獨作用相比,DNA去甲基化可促進miR-21對乳腺癌細胞增殖的抑制作用,此抑制作用主要通過細胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1的表達改變所引起細胞周期發(fā)生改變而得以實現(xiàn)。本研究有助于深入了解乳腺癌的發(fā)生機制,并為日后臨床上制定合理的乳腺癌治療方案提供一定的實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 微小RNA21 DNA甲基化 聯(lián)合作用 細胞增殖
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的和方法13-14
• 一、乳腺癌中miR-21與DNA甲基化的相互調(diào)控研究14-33
• 1.1 對象和方法14-27
• 1.1.1 材料14-17
• 1.1.2 實驗方法及流程17-27
• 1.1.3 統(tǒng)計分析27
• 1.2 結(jié)果27-31
• 1.2.1 miR-21與DNA甲 基化基礎(chǔ)水平在乳腺癌細胞MCF-7 與MDA-MB-231中呈現(xiàn)負相關(guān)27
• 1.2.2 敲低miR-21表達可引起乳腺癌細胞內(nèi)DNA甲基化的改變27-30
• 1.2.3 miR-21可能通過RAS信號通路調(diào)節(jié)乳腺癌細胞內(nèi)DNA甲基化水平30
• 1.2.4 甲基化酶抑制劑 5-Aza可顯著上調(diào)乳腺癌細胞系中miR-21的表達30-31
• 1.3 討論31-32
• 1.4 小結(jié)32-33
• 二、miR-21與DNA甲基化對乳腺癌細胞增殖中的聯(lián)合作用研究33-45
• 2.1 對象和方法33-39
• 2.1.1 材料33-36
• 2.1.2 實驗方法及流程36-38
• 2.1.3 統(tǒng)計分析38-39
• 2.2 結(jié)果39-43
• 2.2.1 miR-21與DNA甲基化對乳腺癌細胞增殖的影響39-41
• 2.2.2 miR-21與DNA甲基化對乳腺癌細胞周期的影響41-43
• 2.3 討論43-44
• 2.4 小結(jié)44-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-50
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明50-51
• 綜述 miR-21與DNA甲基化在乳腺癌中的研究進展51-69
• 綜述參考文獻60-69
• 致謝69

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