發(fā)布時間：2017-09-11 04:28

  本文關(guān)鍵詞：PTEN在肝癌惡性進展過程中促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用研究

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【摘要】：【研究背景和目的】原發(fā)性肝癌主要存在兩種組織類型:肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC),其中肝細(xì)胞肝癌最常見,約占70%到85%[1]。肝炎病毒、酒精性肝病、黃曲霉毒素、吸煙、肥胖等被證明是肝癌發(fā)病的重要危險因素[2]。肝臟腫瘤的臨床發(fā)生一般經(jīng)歷慢性肝炎,長期的慢性刺激或大范圍急性病變發(fā)展成肝硬化,最終肝癌產(chǎn)生[1]。當(dāng)前肝移植及手術(shù)切除等治療方案均未明顯改善患者預(yù)后,而且肝癌肝內(nèi)和門脈轉(zhuǎn)移對患者預(yù)后有重要影響[3]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種因素多階段共同作用的結(jié)果[4],探索肝癌發(fā)生發(fā)展的機制,對于控制和治療肝癌有十分重要的意義。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)是第十號染色體缺失的磷酸酶與張力蛋白類似物。在一些高度惡性腫瘤中常有PTEN缺失,如Cowden綜合征(Cowden’s syndrome),又稱多發(fā)性錯構(gòu)瘤綜合征,它是PTEN胚系突變引起的常染色體遺傳疾病[5]。PTEN具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性,主要通過拮抗PI3K/AKT信號通路,調(diào)控多種生命過程[6],如細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老、細(xì)胞黏附、極性、細(xì)胞骨架、染色體的完整性等[7]。同時也有大量文獻報道PTEN在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中起到了非常重要的作用[5]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指由于各種因素的誘導(dǎo),上皮細(xì)胞自身骨架結(jié)構(gòu)改變,同時細(xì)胞間、細(xì)胞與基底膜間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間聯(lián)系也發(fā)生變化,獲得間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特性的過程[8,9]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤惡性進展的過程中有十分重要的意義[10],有文獻報道鼻咽癌細(xì)胞中,來源于EB病毒的miRNA EBV-miR-BART7-3p靶向抑癌基因PTEN,活化的PI3K/AKT/GSK-3β信號通路使核內(nèi)Snail和β-catenin集聚促進EMT[11]。本課題組先前在探索PTEN肝癌中作用的過程中,發(fā)現(xiàn)肝癌中PTEN的表達并不因為其作為抑癌基因而減少,由此我們意圖通過探討PTEN在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮作用的方式,以及其與EMT的關(guān)系,從而進一步為肝癌患者判斷預(yù)后、評價轉(zhuǎn)移風(fēng)險及尋找肝癌治療新靶點提供相關(guān)的實驗和理論依據(jù)�！狙芯糠椒ā�1、通過蛋白免疫印跡法和實時定量PCR檢測肝癌患者癌、癌旁、正常組織樣品中PTEN的表達情況;并用免疫組織化學(xué)的方法,分析肝癌組織芯片中PTEN的表達。2、通過測序分析肝癌患者癌、正常組織以及肝癌細(xì)胞系中PTEN的突變情況;檢索腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫信息,對PTEN在肝癌中的突變情況進行橫向和縱向比較。3、通過蛋白免疫印跡法檢測肝癌細(xì)胞系中pten的表達水平以及emt相關(guān)蛋白的表達水平;通過cck8增殖、遷移及侵襲實驗比較不同亞群肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力;在低糖培養(yǎng)基下,觀察不同亞群細(xì)胞的耐受能力。4、建立干擾pten穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,并用蛋白免疫印跡、rt-pcr檢測干擾效果及其對于細(xì)胞emt狀態(tài)的影響;評估細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的變化。5、通過蛋白免疫印跡法觀察肝癌細(xì)胞系中過表達pten后,細(xì)胞emt相關(guān)蛋白標(biāo)志的變化;比較過表達pten對于細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力影響。6、使用tgf-β誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系發(fā)生emt,利用蛋白免疫印跡法及實時定量pcr觀察誘導(dǎo)效果。7、使用tgf-β誘導(dǎo)干擾pten肝癌細(xì)胞系發(fā)生emt,利用蛋白免疫印跡法及實時定量pcr觀察誘導(dǎo)效果。8、使用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),研究pten對于e-cadherin轉(zhuǎn)錄活性的影響。9、肝特異性敲除pten小鼠,使用den聯(lián)合ccl4的方案進行誘癌,體內(nèi)試驗研究pten對于在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。10、肝特異性敲除pten小鼠與k-ras激活突變小鼠雜交,觀察小鼠生長�！狙芯拷Y(jié)果】1、盡管pten作為抑癌基因,但是其在肝癌組織中的表達水平相較于癌旁和正常組織并不低。轉(zhuǎn)錄水平也證明癌中pten的表達要高于相應(yīng)的癌旁和正常組織。組織芯片結(jié)果顯示肝癌組織中pten表達并不低。2、27對臨床肝癌組織樣本以及肝癌細(xì)胞中未檢測到pten的突變。檢索tcga數(shù)據(jù)庫,liverhepatocellularcarcinoma(amc,hepatology2014)和liverhepatocellularcarcinoma(tcga,provisional)中,pten突變分別為2%和7%。與其他種類的腫瘤縱向比較,突變水平很低。3、根據(jù)肝癌細(xì)胞系中emt相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達差異,分成以lo2、qsg-7701、smmc-7721、hcc-lm3、plc/ref/5、sk-hep-1為代表的m群,它們高表達vimentin;而e群細(xì)胞有hepg2、huh7、mhcc97h、mhcc97l、pvtt,它們高表達e-cadherin。m群細(xì)胞中pten的表達水平要明顯高于e群細(xì)胞。m群的細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力總體上要比e群的細(xì)胞強,其生長更加依賴于葡萄糖。4、干擾pten,細(xì)胞內(nèi)間質(zhì)性相關(guān)指標(biāo)如n-cadherin、vimentin在蛋白和rna水平均下調(diào)。同時,細(xì)胞的遷移和侵襲能力在干擾pten后要明顯下降。5、上皮型huh7細(xì)胞隨著pten腺病毒量的增加,轉(zhuǎn)錄因子snail的表達量升高,引起e-cadherin的下調(diào),間質(zhì)性標(biāo)志vimentin表達上升。在間質(zhì)型細(xì)胞smmc-7721,過表達PTEN,引起轉(zhuǎn)錄因子Snail上調(diào)的同時也促進了間質(zhì)性指標(biāo)N-cadherin、Vimentin的表達。而且這種作用隨著PTEN過表達程度的增加,呈現(xiàn)出下降趨勢,但仍維持在較高水平。SMMC-7721和Huh7細(xì)胞中過表達PTEN后:細(xì)胞的增殖能力呈現(xiàn)下降趨勢;遷移能力在一定水平增加,超過一定程度出現(xiàn)減弱。6、TGFβ處理后,肝癌細(xì)胞PTEN的表達在蛋白水平上調(diào)。實時定量PCR也證明在轉(zhuǎn)錄水平,TGFβ的作用使細(xì)胞出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,PTEN的表達上調(diào)。7、干擾PTEN背景下,TGFβ誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT的效應(yīng)減弱。8、PTEN影響CDH1轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性;TGFβ促進PTEN啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性。9、PTEN在腫瘤發(fā)生的早期具有抑癌作用。10、KPC小鼠自發(fā)生成膽管癌�！窘Y(jié)論】在肝癌發(fā)生的早期,PTEN具有抑制腫瘤發(fā)生的作用。而在肝癌發(fā)生后,PTEN高表達促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,低表達時腫瘤發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力相對降低。LSL-Kras~(G12D/+),PTEN~(flox/flox),Alb-cre小鼠可以作為一種新型的膽管癌模型。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 PTEN 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化生長因子β 腫瘤轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-9
• 英文縮略詞表9-10
• 前言10-12
• 材料和方法12-28
• 實驗結(jié)果28-40
• 一、PTEN在肝癌組織中的表達并未下調(diào)28-29
• 二、PTEN在肝癌中的突變率很低29-30
• 三、根據(jù)EMT相關(guān)蛋白，肝癌細(xì)胞可以分成E群和M群30-32
• 四、干擾肝癌細(xì)胞PTEN的表達對于上皮和間質(zhì)指標(biāo)的影響32-34
• 五、在肝癌細(xì)胞系中過表達PTEN促進細(xì)胞向間質(zhì)型轉(zhuǎn)化34-35
• 六、TGF-β 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系發(fā)生EMT，，細(xì)胞PTEN表達量增加35-36
• 七、干擾PTEN背景下，TGF-β 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT的效應(yīng)減弱36
• 八、PTEN影響CDH1轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性36-37
• 九、PTEN在腫瘤發(fā)生的早期發(fā)揮抑癌作用37-38
• 十、KPC小鼠能夠自發(fā)生成膽管癌38-40
• 討論40-43
• 參考文獻43-48
• 附錄48-49
• 綜述 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤的關(guān)系研究進展49-60
• 參考文獻55-60
• 在讀期間發(fā)表的文章60-61
• 致謝61-62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：828634