本文關鍵詞：端粒酶抑制劑MST-312對人肝癌HepG2細胞輻射敏感性的影響及機制探討

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【摘要】：目的：研究端粒酶抑制劑MST-312對人肝癌HepG2細胞輻射敏感性的影響并探討其作用機制。材料和方法：應用MTT法對MST-312的細胞毒性進行檢測,篩選合適的藥物濃度；選取X射線2 Gy對MST-312預處理的細胞進行輻照后,采用克隆形成實驗檢測細胞存活率,觀察MST-312對細胞的輻射增敏性的影響；分別采用流式細胞儀和Hoechst 33258熒光染色法對輻照后細胞周期以及凋亡情況進行檢測；Western blot法檢測細胞損傷、修復及凋亡相關蛋白表達水平的變化；應用Real-time fluorescent quantitative PCR技術檢測細胞內(nèi)端粒酶活性；激光共聚焦顯微鏡觀察γ-H2AX、XRCC4和Rad51在細胞內(nèi)的分布及數(shù)量,衡量DNA損傷程度及修復情況；利用靶向性探針JC-1對線粒體的膜電勢丟失情況進行檢測。結(jié)果：1.MTT法的結(jié)果顯示MST-312對HepG2細胞增殖抑制作用呈劑量依賴性,4 μM的MST-312對HepG2細胞的增殖抑制率較小,而且對細胞的形態(tài)沒有明顯影響；克隆形成實驗結(jié)果顯示,藥物+輻照組的克隆形成率較單獨輻照組明顯降低；經(jīng)流式細胞術分析,輻照后12 h能夠引起顯著G2/M期阻滯,但隨著時間延長至24 h,與單獨輻照組相比,藥物+輻照中阻滯于G2/M期的細胞比例下降、同時Sub-G1細胞比例上升；Hoechst 33258熒光染色表明,在輻照后24 h,與單獨輻照組相比,藥物+輻照組中HepG2細胞出現(xiàn)了更加明顯的凋亡形態(tài)變化；除此之外,輻照后24 h,藥物+輻照組γ-H2AX蛋白表達量高于單獨輻照組,此結(jié)果提示DNA損傷嚴重,未完全修復。2.通過Real-time fluorescent quantitative PCR分析得出,2 Gy的X射線上調(diào)hTERT的1nRNA表達,而MST-312能夠有效地抑制HepG2細胞的內(nèi)在和輻射誘導的hTERT的mRNA表達,即端粒酶活性；激光共聚焦顯微鏡觀察到MST-312與X射線聯(lián)合處理的細胞中存在著大量的γ-H2AX焦點,但同源重組修復(homologous recombination repair, HR)蛋白Rad51焦點被大量聚集在細胞核外；JC-1結(jié)果顯示,與單獨輻照組相比,藥物+輻照組細胞內(nèi)綠色熒光強度/紅色熒光強度的比值升高,線粒體膜電勢△ψm損失更為嚴重；Western blot的結(jié)果顯示,與單獨輻照組相比,藥物+輻照組的p53蛋白表達增加、Bcl-2/Bax比值和caspase-3蛋白酶原表達量都有所降低。結(jié)論：端粒酶抑制劑MST-312對人肝癌HepG2細胞具有顯著的輻射增敏作用；增敏作用機制與MST-312抑制端粒酶活性而引起端粒酶功能異常和影響DSBs修復的HR途徑有關；MST-312不僅增加了輻射誘導的DNA損傷,而且影響了損傷DNA的修復,使得HepG2細胞通過p53依賴的線粒體途徑走向凋亡。
【關鍵詞】：端粒 端粒酶抑制劑 X射線 輻射敏感性 DNA損傷修復
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 引言10-20
• 1.1 端粒、端粒酶的結(jié)構(gòu)及功能10-12
• 1.1.1 端粒的結(jié)構(gòu)與功能10-11
• 1.1.2 端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能11-12
• 1.2 端粒、端粒酶與腫瘤細胞輻射敏感性12-14
• 1.2.1 端粒、端粒酶與腫瘤細胞的關系12-13
• 1.2.2 端粒、端粒酶與腫瘤細胞輻射敏感性13-14
• 1.3 端粒、端粒酶與細胞輻射損傷修復14-15
• 1.4 端粒酶抑制劑的種類及其在放療中的應用15-20
• 1.4.1 端粒酶抑制劑的種類及作用機制15-18
• 1.4.2 端粒酶抑制劑在放療中的應用18-20
• 第二章 端粒酶抑制劑MST-312對人肝癌HepG2細胞輻射敏感性的影響20-31
• 2.1 實驗材料20-21
• 2.1.1 主要實驗儀器20-21
• 2.1.2 主要實驗試劑21
• 2.2 實驗方法和步驟21-24
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)及凍存21-22
• 2.2.2 輻照條件及實驗分組22
• 2.2.3 MST-312的配制22
• 2.2.4 甲基偶氮唑藍(MTT)實驗22
• 2. 2.5克隆形成實驗22-23
• 2.2.6 克隆形成實驗23
• 2.2.7 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡情況23
• 2.2.8 Western blot檢測γ-H2AX蛋白表達水平23
• 2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析23-24
• 2.3 結(jié)果24-28
• 2.3.1 MST-312對HepG2細胞的增殖抑制作用及周期分布影響24-25
• 2.3.2 MST-312降低X射線輻照后HepG2細胞的克隆形成率25
• 2.3.3 MST-312增加X射線輻照后HepG2細胞sub-G1期的比例25-26
• 2.3.4 MST-312促進X射線誘導的HepG2細胞凋亡26-27
• 2.3.5 MST-312增強X射線對HepG2細胞的DNA損傷27-28
• 2.4 討論28-31
• 第三章 端粒酶抑制劑MST-312增強人肝癌HepG2細胞輻射敏感性的機制研究31-46
• 3.1 實驗材料31-32
• 3.1.1 主要實驗儀器31-32
• 3.1.2 主要實驗試劑32
• 3.2 實驗方法和步驟32-37
• 3.2.1 細胞復蘇與培養(yǎng)32-33
• 3.2.2 輻照條件及實驗分組33
• 3.2.3 Real-time Fluorescent Quantitative PCR檢測端粒酶活性33-35
• 3.2.4 激光共聚焦檢測DNA損傷修復蛋白35-36
• 3.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平36-37
• 3.2.6 JC-1檢測線粒體膜電位37
• 3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析37
• 3.3 結(jié)果37-44
• 3.3.1 MST-312抑制HepG2細胞內(nèi)在的和輻射誘導的端粒酶活性37-38
• 3.3.2 MST-312增加X射線輻射后HepG2細胞核內(nèi)γ-H2AX焦點的形成38-39
• 3.3.3 MST-312影響X射線輻射后HepG2細胞的DSBs修復39-40
• 3.3.4 MST-312上調(diào)X射線輻射后HepG2細胞的p53蛋白表達水平40-41
• 3.3.5 MST-312降低X射線輻射后HepG2細胞的線粒體膜電位41-42
• 3.3.6 MST-312改變X射線輻照后HepG2細胞Bcl-2與Bax蛋白比值,及下調(diào)caspase-3蛋白表達42-44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻47-53
• 在校期間的研究成果53-54
• 致謝54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭月鳳;;端粒與輻射敏感性[J];輻射研究與輻射工藝學報;2006年03期

2 楊立娜;冉俊濤;張紅;劉圓圓;張秋寧;高力英;王小虎;;重離子束治療腫瘤臨床研究[J];原子核物理評論;2013年02期

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本文編號：817073