本文關(guān)鍵詞：端粒酶抑制劑MST-312對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞輻射敏感性的影響及機(jī)制探討

  更多相關(guān)文章： 端粒 端粒酶抑制劑 X射線 輻射敏感性 DNA損傷修復(fù)

【摘要】：目的：研究端粒酶抑制劑MST-312對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞輻射敏感性的影響并探討其作用機(jī)制。材料和方法：應(yīng)用MTT法對(duì)MST-312的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè),篩選合適的藥物濃度；選取X射線2 Gy對(duì)MST-312預(yù)處理的細(xì)胞進(jìn)行輻照后,采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率,觀察MST-312對(duì)細(xì)胞的輻射增敏性的影響；分別采用流式細(xì)胞儀和Hoechst 33258熒光染色法對(duì)輻照后細(xì)胞周期以及凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞損傷、修復(fù)及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化；應(yīng)用Real-time fluorescent quantitative PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性；激光共聚焦顯微鏡觀察γ-H2AX、XRCC4和Rad51在細(xì)胞內(nèi)的分布及數(shù)量,衡量DNA損傷程度及修復(fù)情況；利用靶向性探針JC-1對(duì)線粒體的膜電勢(shì)丟失情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：1.MTT法的結(jié)果顯示MST-312對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制作用呈劑量依賴性,4 μM的MST-312對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制率較小,而且對(duì)細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯影響；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藥物+輻照組的克隆形成率較單獨(dú)輻照組明顯降低；經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析,輻照后12 h能夠引起顯著G2/M期阻滯,但隨著時(shí)間延長(zhǎng)至24 h,與單獨(dú)輻照組相比,藥物+輻照中阻滯于G2/M期的細(xì)胞比例下降、同時(shí)Sub-G1細(xì)胞比例上升；Hoechst 33258熒光染色表明,在輻照后24 h,與單獨(dú)輻照組相比,藥物+輻照組中HepG2細(xì)胞出現(xiàn)了更加明顯的凋亡形態(tài)變化；除此之外,輻照后24 h,藥物+輻照組γ-H2AX蛋白表達(dá)量高于單獨(dú)輻照組,此結(jié)果提示DNA損傷嚴(yán)重,未完全修復(fù)。2.通過Real-time fluorescent quantitative PCR分析得出,2 Gy的X射線上調(diào)hTERT的1nRNA表達(dá),而MST-312能夠有效地抑制HepG2細(xì)胞的內(nèi)在和輻射誘導(dǎo)的hTERT的mRNA表達(dá),即端粒酶活性；激光共聚焦顯微鏡觀察到MST-312與X射線聯(lián)合處理的細(xì)胞中存在著大量的γ-H2AX焦點(diǎn),但同源重組修復(fù)(homologous recombination repair, HR)蛋白R(shí)ad51焦點(diǎn)被大量聚集在細(xì)胞核外；JC-1結(jié)果顯示,與單獨(dú)輻照組相比,藥物+輻照組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度/紅色熒光強(qiáng)度的比值升高,線粒體膜電勢(shì)△ψm損失更為嚴(yán)重；Western blot的結(jié)果顯示,與單獨(dú)輻照組相比,藥物+輻照組的p53蛋白表達(dá)增加、Bcl-2/Bax比值和caspase-3蛋白酶原表達(dá)量都有所降低。結(jié)論：端粒酶抑制劑MST-312對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞具有顯著的輻射增敏作用；增敏作用機(jī)制與MST-312抑制端粒酶活性而引起端粒酶功能異常和影響DSBs修復(fù)的HR途徑有關(guān)；MST-312不僅增加了輻射誘導(dǎo)的DNA損傷,而且影響了損傷DNA的修復(fù),使得HepG2細(xì)胞通過p53依賴的線粒體途徑走向凋亡。
【關(guān)鍵詞】：端粒 端粒酶抑制劑 X射線 輻射敏感性 DNA損傷修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一章 引言10-20
• 1.1 端粒、端粒酶的結(jié)構(gòu)及功能10-12
• 1.1.1 端粒的結(jié)構(gòu)與功能10-11
• 1.1.2 端粒酶的結(jié)構(gòu)與功能11-12
• 1.2 端粒、端粒酶與腫瘤細(xì)胞輻射敏感性12-14
• 1.2.1 端粒、端粒酶與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系12-13
• 1.2.2 端粒、端粒酶與腫瘤細(xì)胞輻射敏感性13-14
• 1.3 端粒、端粒酶與細(xì)胞輻射損傷修復(fù)14-15
• 1.4 端粒酶抑制劑的種類及其在放療中的應(yīng)用15-20
• 1.4.1 端粒酶抑制劑的種類及作用機(jī)制15-18
• 1.4.2 端粒酶抑制劑在放療中的應(yīng)用18-20
• 第二章 端粒酶抑制劑MST-312對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞輻射敏感性的影響20-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟21-24
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及凍存21-22
• 2.2.2 輻照條件及實(shí)驗(yàn)分組22
• 2.2.3 MST-312的配制22
• 2.2.4 甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)22
• 2. 2.5克隆形成實(shí)驗(yàn)22-23
• 2.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)23
• 2.2.7 Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況23
• 2.2.8 Western blot檢測(cè)γ-H2AX蛋白表達(dá)水平23
• 2.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析23-24
• 2.3 結(jié)果24-28
• 2.3.1 MST-312對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用及周期分布影響24-25
• 2.3.2 MST-312降低X射線輻照后HepG2細(xì)胞的克隆形成率25
• 2.3.3 MST-312增加X射線輻照后HepG2細(xì)胞sub-G1期的比例25-26
• 2.3.4 MST-312促進(jìn)X射線誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡26-27
• 2.3.5 MST-312增強(qiáng)X射線對(duì)HepG2細(xì)胞的DNA損傷27-28
• 2.4 討論28-31
• 第三章 端粒酶抑制劑MST-312增強(qiáng)人肝癌HepG2細(xì)胞輻射敏感性的機(jī)制研究31-46
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器31-32
• 3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟32-37
• 3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)32-33
• 3.2.2 輻照條件及實(shí)驗(yàn)分組33
• 3.2.3 Real-time Fluorescent Quantitative PCR檢測(cè)端粒酶活性33-35
• 3.2.4 激光共聚焦檢測(cè)DNA損傷修復(fù)蛋白35-36
• 3.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平36-37
• 3.2.6 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位37
• 3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析37
• 3.3 結(jié)果37-44
• 3.3.1 MST-312抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)在的和輻射誘導(dǎo)的端粒酶活性37-38
• 3.3.2 MST-312增加X射線輻射后HepG2細(xì)胞核內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的形成38-39
• 3.3.3 MST-312影響X射線輻射后HepG2細(xì)胞的DSBs修復(fù)39-40
• 3.3.4 MST-312上調(diào)X射線輻射后HepG2細(xì)胞的p53蛋白表達(dá)水平40-41
• 3.3.5 MST-312降低X射線輻射后HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位41-42
• 3.3.6 MST-312改變X射線輻照后HepG2細(xì)胞Bcl-2與Bax蛋白比值,及下調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)42-44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 在校期間的研究成果53-54
• 致謝54

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 郭月鳳;;端粒與輻射敏感性[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào);2006年03期

2 楊立娜;冉俊濤;張紅;劉圓圓;張秋寧;高力英;王小虎;;重離子束治療腫瘤臨床研究[J];原子核物理評(píng)論;2013年02期

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本文編號(hào)：817073