本文關(guān)鍵詞：缺氧誘導(dǎo)因子1α調(diào)控2型谷氨酰胺酶促進(jìn)結(jié)腸癌耐藥的機(jī)制及臨床意義研究

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【摘要】：結(jié)腸癌是人類最常見的消化道腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率多年來居高不下。近年來隨著化療方案的不斷更新使得結(jié)腸癌的治療效果有所提升,但患者對(duì)治療反應(yīng)不一,獲益率差異較大,以及由耐藥引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是進(jìn)一步提高療效的主要障礙。代謝模式的多樣性是惡性腫瘤的重要特征,其不僅在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,同時(shí)也是惡性細(xì)胞在面對(duì)化療壓力時(shí)得以存活的根本保障。因此,深入研究結(jié)腸癌化療耐受情況下腫瘤代謝改變及調(diào)控機(jī)制,不僅可以闡明結(jié)腸癌化療耐受的分子機(jī)制,而且可以通過對(duì)特定細(xì)胞代謝途徑或代謝產(chǎn)物的調(diào)控,為逆轉(zhuǎn)耐藥尋找新的靶點(diǎn)。缺氧是實(shí)體腫瘤的重要特征之一,而缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)作為其關(guān)鍵的中間分子,在對(duì)腫瘤代謝等方面起著主要的調(diào)控作用。同時(shí)缺氧條件下谷氨酰胺(Gln)的轉(zhuǎn)運(yùn)、合成與利用均增加,但是具體的分子機(jī)制目前尚不明確。Gln在其代謝關(guān)鍵酶2型谷氨酰胺酶(GLS2)的作用下脫氨基生成谷氨酸(Glu)。一方面,Glu可反應(yīng)生成α-酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán))起“回補(bǔ)作用”,從而為TCA循環(huán)提供因腫瘤細(xì)胞合成代謝增強(qiáng)而減少的中間代謝產(chǎn)物;另一方面,Glu可在谷胱甘肽合成酶系的催化下,生成谷胱甘肽(GSH)與多種化療藥物反應(yīng),增加藥物的排出,降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的濃度以及增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)功能,最終引起腫瘤細(xì)胞的耐藥。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)缺氧條件下結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)化療不敏感,同時(shí)耐藥結(jié)腸癌細(xì)胞株中HIF-1α和GLS2的表達(dá)均升高,在此基礎(chǔ)上,初步探討了HIF-1α通過對(duì)GLS2進(jìn)行調(diào)控影響了谷氨酰胺的代謝,最終引起結(jié)腸癌化療耐受,為逆轉(zhuǎn)耐藥提供新的策略。同時(shí),采用免疫組化法檢測(cè)了HIF-1α和GLS2在結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中的表達(dá),并且探討其臨床意義,進(jìn)而為臨床診治提供新的線索。實(shí)驗(yàn)方法:第一部分(1)分別在常氧(20%O_2)和缺氧(1%O_2)不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、36h、48h、72h)的條件下處理結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo后,Western Blot檢測(cè)HIF-1α的表達(dá);(2)分別在20%O_2和1%O_2條件下用結(jié)腸癌化療藥物奧沙利鉑(OXA)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)處理Lovo細(xì)胞48h后,CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性;(3)Western Blot檢測(cè)HCT-116、HCT-116/OXA、HCT-8和HCT-8/5-Fu中HIF-1α、缺氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α)、1型谷氨酰胺酶(GLS1)和GLS2的表達(dá)。第二部分(1)通過慢病毒敲低HIF-1α,構(gòu)建HIF-1α~(KD)的Lovo細(xì)胞株,在20%O_2和1%O_2處理12h后,Western Blot檢測(cè)HIF-1α和GLS2的表達(dá);(2)通過慢病毒過表達(dá)HIF-1α,構(gòu)建HIF-1α~(OE)的Lovo細(xì)胞株,Western Blot檢測(cè)HIF-1α和GLS2的表達(dá);(3)通過臨床數(shù)據(jù)庫ICGC對(duì)GLS2和不同HIF-1α靶基因之間的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析;(4)通過基因數(shù)據(jù)庫分析GLS2啟動(dòng)子序列與HIF-1α靶基因序列的相似程度;(5)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)HIF-1α對(duì)GLS2轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)活性。第三部分(1)通過慢病毒敲低HIF-1α~(OE)組Lovo細(xì)胞中的GLS2,構(gòu)建HIF-1α~(OE)+GLS2~(KD) Lovo細(xì)胞株;(2)GSH檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)WT、Ctr、HIF-1α~(OE)、HIF-1α~(OE)+GLS2~(KD)四組Lovo細(xì)胞中GSH水平;(3)分別用OXA和5-Fu處理WT、Ctr、HIF-1α~(OE)、HIF-1α~(OE)+GLS2~(KD)、HIF-1α~(OE)+H2O_2五組Lovo細(xì)胞48h后,CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。第四部分(1)免疫組化法檢測(cè)結(jié)直腸癌術(shù)后108例組織標(biāo)本(其中23例含癌旁黏膜組織)中HIF-1α和GLS2的表達(dá),并分析二者的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;(2)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析HIF-1α和GLS2的表達(dá)之間的相關(guān)性,Kaplan-Meier法分析結(jié)直腸癌中HIF-1α和GLS2的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系,Cox回歸模型分析結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素。結(jié)果:1、缺氧通過促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)參與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥1%O_2處理Lovo細(xì)胞12h時(shí)HIF-1α表達(dá)水平最高;OXA或5-Fu處理細(xì)胞后,1%O_2組的Lovo細(xì)胞增殖活性均較20%O_2組強(qiáng);相較于野生型結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和HCT-8,耐藥細(xì)胞株HCT-116/OXA和HCT-8/5-Fu中HIF-1α和GLS2的表達(dá)均增高,而HIF-2α和GLS1無明顯變化。2、HIF-1α通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進(jìn)GLS2的表達(dá)缺氧時(shí)敲低HIF-1α,GLS2的表達(dá)隨之降低;常氧時(shí)過表達(dá)HIF-1α,GLS2的表達(dá)隨之升高;臨床數(shù)據(jù)庫ICGC分析發(fā)現(xiàn)GLS2和不同HIF-1α靶基因之間的表達(dá)存在明顯正相關(guān);基因數(shù)據(jù)庫TRANSFAC MATRIX TABLE分析GLS2啟動(dòng)子序列與HIF-1α靶基因序列的相似度為99.8%;熒光素酶報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)HIF-1α能夠啟動(dòng)GLS2的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)將GLS2的啟動(dòng)子序列突變以后HIF-1α對(duì)其的啟動(dòng)活性隨之下降。3、HIF-1α通過提高GSH水平促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥過表達(dá)HIF-1α?xí)rGSH水平升高,敲低GLS2后GSH水平隨之下降;OXA或5-Fu處理細(xì)胞后,過表達(dá)HIF-1α?xí)r細(xì)胞增殖活性增強(qiáng),但在加入H2O_2或敲低GLS2后,細(xì)胞的增殖活性隨之下降。4、HIF-1α和GLS2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義結(jié)直腸癌組織中HIF-1α和GLS2的表達(dá)均明顯高于癌旁黏膜組織,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。其中,HIF-1α的表達(dá)與年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05),而GLS2的表達(dá)則與年齡、浸潤深度、術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05)。同時(shí),HIF-1α和GLS2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.464,P0.01),且二者均與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后有關(guān);Cox回歸分析也顯示TNM分期、術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、HIF-1α、GLS2均是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素(P0.05)。結(jié)論:HIF-1α作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,缺氧時(shí)其表達(dá)明顯增高,且與結(jié)腸癌耐藥密切相關(guān),它通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控GLS2的表達(dá),促進(jìn)GSH的合成進(jìn)而引起結(jié)腸癌細(xì)胞的化療耐藥;同時(shí)結(jié)直腸癌患者中HIF-1α、GLS2高表達(dá)組的預(yù)后均比低表達(dá)組的差,提示二者可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 缺氧誘導(dǎo)因子1α 2型谷氨酰胺酶 化療耐藥 奧沙利鉑 5-氟尿嘧啶
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 缺氧通過促進(jìn)HIF-1α 的表達(dá)參與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥16-26
• 2.1 材料與方法16-23
• 2.2 結(jié)果23-24
• 2.3 討論24-25
• 2.4 小結(jié)25-26
• 第三章 HIF-1α 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控促進(jìn)GLS2的表達(dá)26-36
• 3.1 材料與方法26-31
• 3.2 結(jié)果31-34
• 3.3 討論34-35
• 3.4 小結(jié)35-36
• 第四章 HIF-1α 通過提高GSH水平促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥36-43
• 4.1 材料與方法36-39
• 4.2 結(jié)果39-41
• 4.3 討論41-42
• 4.4 小結(jié)42-43
• 第五章 HIF-1α 和GLS2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義43-49
• 5.1 材料與方法43-45
• 5.2 結(jié)果45-48
• 5.3 討論48
• 5.4 小結(jié)48-49
• 全文總結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 文獻(xiàn)綜述 缺氧和缺氧誘導(dǎo)因子與腫瘤代謝54-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 研究生期間主要發(fā)表的論文64-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：812988