本文關(guān)鍵詞：miR-503靶基因PRKACA的鑒定及其在食管鱗癌細胞中的生物學功能

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【摘要】：目的:檢測應激條件下mi R-503的表達;鑒定mi R-503的靶基因PRKACA;研究PRKACA基因編碼的蛋白對食管鱗癌細胞Eca9706和Eca109功能的影響及其生物學機制。方法:1、分別在缺糖、缺氧及饑餓條件下培養(yǎng)Eca109和Eca9706細胞,采用Taqman探針法檢測mi R-503的表達情況。2、體外設計并合成3組干擾PRKACA mRNA表達的siRNA,采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞株Eca109和Eca9706。3、Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染PRKACA-siRNA后Eca109的PRKACA蛋白的表達水平,評估干擾效果。4、通過CCK-8試劑盒檢測干擾PRKACA基因表達后Eca109和Eca9706細胞增殖能力的改變。5、Transwell侵襲實驗法檢測PRKACA對Eca109和Eca9706細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。6、利用流式細胞術(shù)分析PRKACA基因?qū)ca109和Eca9706細胞周期的影響。7、將mi R-503mimics及mi R-503 negative control分別轉(zhuǎn)染Ec a109,之后采用偶聯(lián)AGO2抗體的beads來免疫沉淀mi RNA-m RNA-AGO2蛋白復合體,而在另一組實驗中采用Ig G替換AGO2抗體,然后都用TRizol法來抽提沉淀的總RNA,最后實時定量PCR法檢測PRKACA m RNA的表達。8、擴增PRKACA 3’-UTR的種子區(qū)及突變種子區(qū),且在兩端加上SpeⅠ和HindⅢ酶切位點后構(gòu)建至雙熒光素酶報告質(zhì)粒pMIR-PRKACA和pmir-prkaca-mutant;將mir-503mimics、mir-503negativecontrol、pmir-prkaca和pmir-prkaca-mutant,分別共轉(zhuǎn)染hek293細胞;裂解細胞后加入底物,檢測熒光素酶活性。9、通過生物信息學方法即go基因分類法、keggpathways法預測mir-503在食管鱗癌中靶基因。10、統(tǒng)計學分析:所有實驗數(shù)據(jù)均使用spss17.0統(tǒng)計軟件包,兩指標間的比較采用lsd-t檢驗,兩項以上的采用單因素方差分析;計量資料采用t檢驗;差異性分析用配對χ2檢驗;相關(guān)性檢驗用spearman相關(guān)分析,以α=0.05為標準。結(jié)果:1、taqman探針法結(jié)果表明,在缺糖、缺氧及饑餓條件下,eca109和eca9706中的mir-503的表達水平顯著升高;2、sirna轉(zhuǎn)染eca109細胞,分別命名為prkaca-sirna-eca109-1、prkaca-sirna-eca109-2、prkaca-sirna-eca109-3和sirna-nc組,經(jīng)過48h的培養(yǎng),使用westernblot篩選對prkaca基因表達干擾效果最好的sirna。3、轉(zhuǎn)染sirna-prkaca后48h,與對照組比較的結(jié)果顯示,prkaca-sirna-eca109-3組的prkaca蛋白的表達水平明顯降低(p0.05),顯示干擾sirna序列能夠顯著下調(diào)prkaca的表達,同時vimentin表達相對下調(diào),e-cadherin表達升高,cyclind1和cycline1蛋白的表達水平降低。4、cck-8實驗結(jié)果顯示,prkaca基因抑制組食管鱗癌細胞增殖速度減慢(p0.05),對照組細胞的增殖速度加快(p0.05)。表明prkaca能夠促進食管鱗癌細胞的增殖;5、transwell實驗檢測干擾組食管鱗癌細胞。遷移實驗,eca109的mimics組鏡下細胞數(shù)是55個,eca9706(x100)的mimics組為82個;侵襲實驗,eca109及eca9706的mimics組分別為47、51個;兩個細胞株的兩組實驗相較對照組都有顯著性差異(p0.05)。說明prkaca基因的表達能夠促進eca109及eca9706細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。6、流式細胞檢測sirna-prkaca陽性的eca細胞。eca109組g0/g1細胞比例61.47%,s期比例20.95%,g2/m期17.58%;eca9706組g0/g1細胞比例68.18%,s期比例17.61%,g2/m期14.21%;兩組細胞與對照組比較均有顯著性差異(p0.05)。表明prkaca基因的抑制可以導致食管鱗癌細胞g1期的阻滯。7、通過go基因分類法、keggpathways法發(fā)現(xiàn)與mir-503緊密相關(guān)的prkcg、prkaca、rictor、smad7、wnt4及wnt3a,都可能是mir-503的靶基因。8、rip實驗顯示,mir-503mimics組prkacamrna的表達水平顯著高于mir-503negativecontrol組(p0.05),推測prkaca是mir-503的靶基因。9、實驗組中熒光素酶活性相比對照組顯著降低(p0.05),顯示mir-503mimics對pmir-prkaca的熒光素酶表達有抑制作用,提示prkaca是mir-503的靶基因;mir-503mimics和pmir-prkaca-mutant共轉(zhuǎn)染組熒光強度顯著降低,而對照組無顯著改變,說明mir-503mimics對pmir-prkaca-mutant表達有抑制作用,表明prkaca是mir-503的靶基因。結(jié)論:1.說明缺氧、缺糖及饑餓是誘發(fā)食管鱗癌細胞mir-503表達升高的重要因素。2.sirna干擾prkaca蛋白,提示prkaca具有促進食管鱗癌細胞的增殖、侵襲及遷移的作用。3.通過生物學預測,prkcg、prkaca、rictor、smad7、WNT4及WNT3A可能為miR-503的靶基因。4.RNA免疫共沉淀及雙熒光素酶活性實驗顯示mi R-503的候選靶基因為PRKACA,且靶向抑制PRKACA的表達。5.miR-503及PRKACA基因的可作為判斷食管鱗癌患者預后的一個潛在的預測指標。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗癌 mi R-503 PRKACA 靶基因
【學位授予單位】：四川醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-33
• 結(jié)果33-50
• 討論50-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻59-69
• DNA甲基化在食管癌防治中的研究（綜述）69-75
• 參考文獻72-75
• 英漢縮略詞對照表75-77
• 致謝77-78

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Antonia Digklia;Ioannis A Voutsadakis;;Targeted treatments for metastatic esophageal squamous cell cancer[J];World Journal of Gastrointestinal Oncology;2013年05期

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本文編號：801149