本文關(guān)鍵詞：COX-2抑制劑對(duì)低氧狀態(tài)下骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：骨肉瘤(osteosarcoma)是骨組織中最常見的惡性腫瘤,來(lái)源于問葉組織,大約占原發(fā)性骨惡性腫瘤的20%,發(fā)病率為(0.01-0.03)/1萬(wàn)。任何年齡均可發(fā)病,但好發(fā)于青少年。發(fā)病率在種族間沒有明顯差異,與遺傳因素關(guān)系不密切。本病預(yù)后極差,致死率及因截肢造成的致殘率均較高,早期經(jīng)血道、淋巴道發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的主要原因之一。低氧作為實(shí)體腫瘤的特征及生存的重要環(huán)境,這不僅讓腫瘤自身的侵襲性增加,并且使腫瘤對(duì)化療的耐藥及放療的抗拒性均增加。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境中最關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子是低氧誘導(dǎo)因子-1 (Hypoxia-inducible factor-1, HIF-1),這也是低氧時(shí)調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因素,HIF-1a的表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。當(dāng)實(shí)體腫瘤處在低氧環(huán)境時(shí),HIF-1a表達(dá)上調(diào)且活性顯著增高,調(diào)節(jié)下游多個(gè)基因。目前已發(fā)現(xiàn)的HIF-1α的目的基因蛋白產(chǎn)物中有與血管生成相關(guān)的因子、糖酵解酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)酶、與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白、與腫瘤增殖和凋亡相關(guān)的蛋白等,具體涉及到促紅細(xì)胞生成素(EPO)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,酪氨酸3-單加氧酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 (glucose transporter, GLUT-1)、GLUT-3、血紅素氧化酶I(HMOX1)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNO S、糖酵解酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)等,從而有利于腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧的微環(huán)境,并促進(jìn)腫瘤血管的再生,加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞能量代謝,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的一系列生物學(xué)特性的變化。由于化療藥物的最終效應(yīng)是抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,故而研究化療藥物誘導(dǎo)低氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制可為臨床治療提供基礎(chǔ)和理論依據(jù)。環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase, COX)即前列腺素過氧化物酶合成酶,是花生四烯酸分解生成各種內(nèi)源性前列腺素(PG)過程中重要的限速酶,有兩種形式即COX-1 和 COX-2。 COX-2在骨肉瘤組織中表達(dá)上調(diào),COX-2致癌的具體機(jī)制仍然不太清楚,但目前的研究發(fā)現(xiàn),它過度表達(dá)可增加其代謝產(chǎn)物前列腺素E2(PGE2)合成來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,PGE2還可增加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和 VEGF等促進(jìn)血管生成因子的表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤血管形成。COX-2在促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞凋亡、抑制機(jī)體免疫反應(yīng)等多方面對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展均起了極為重要的作用。隨著對(duì)COX-2的過度表達(dá)與腫瘤關(guān)系研究的不斷深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑有抗腫瘤作用。機(jī)制可能與減弱腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng),阻滯腫瘤細(xì)胞周期,減少腫瘤血管生成,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,削弱腫瘤細(xì)胞侵襲能力及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。此外還有研究表明COX-2抑制劑抗腫瘤還可以通過非COX-2途徑。本研究針對(duì)骨肉瘤中 HIF-1α蛋白大量表達(dá)的特點(diǎn),實(shí)驗(yàn)以化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)劑氯化鈷(CoCl2)模擬體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞低氧狀態(tài),觀察COX-2抑制劑NS-398對(duì)低氧狀態(tài)下骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的影響,并探討其機(jī)制。目的：1.探討低氧狀態(tài)下骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的影響。2.探討COX-2抑制劑對(duì)低氧狀態(tài)下MG-63細(xì)胞周期的影響。3.初步探討COX-2抑制劑對(duì)低氧狀態(tài)下人MG-63細(xì)胞凋亡的影響及可能的機(jī)制。方法：選用化學(xué)性缺氧誘導(dǎo)劑氯化鉆(濃度為200μmol/L)處理骨肉瘤MG-63細(xì)胞,建立化學(xué)性低氧環(huán)境,再將MG-63細(xì)胞培養(yǎng)48h后,以不同濃度COX-2抑制劑NS-398(0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、和100μmol/L)分別作用于造模后的MG-63細(xì)胞。設(shè)常氧組作對(duì)照,行低氧造模后加入不同濃度NS-398分別稱作0gmol/L組、25μmol/L組、50μmol/L組和100μmol/L組。1.以四甲基偶氮唑鹽(MTT)法分別檢測(cè)常氧組和對(duì)不同濃度的NS-398處理MG-63細(xì)胞后24h和48h兩個(gè)時(shí)間段MG-63細(xì)胞增殖活力的影響：2.用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)常氧組和不同濃度的NS-398作用后MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)周期變化、發(fā)生凋亡的影響。3Western blot分別測(cè)定常氧組和不同濃度的NS-398作用后MG-63細(xì)胞中HIF-1α蛋白、凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)。結(jié)果：1.行氯化鉆缺氧造模后,MTT法檢測(cè)0μmol/L組MG-63細(xì)胞的活力較常氧組明顯增強(qiáng)(P0.05),加入NS-398處理24h后,MG-63細(xì)胞的增殖受到抑制,48h后MG-63細(xì)胞增殖活力明顯被抑制,48h后25μmol/L組、50μmol/L組和100μmol/L組的MG-63細(xì)胞增殖抑制率分別為30.6%(P0.05),48.5%(P0.05),59.4%(P0.05),并具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。2.在低氧狀態(tài)下的MG-63細(xì)胞較常氧組MG-63細(xì)胞生長(zhǎng)周期發(fā)生變化,經(jīng)不同濃度NS-398處理48h后,MG-63細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯,與Oμmol/L組相比,25μamol/L組、50μmol/L組和100μmol/L組MG-63細(xì)胞G0/G1期比例增加,S、G2/M期比例降低,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.在低氧狀態(tài)下,0μmol/L組MG-63細(xì)胞的中HIF-1α蛋白及Survivin的表達(dá)較常氧組增加,加入NS-398處理后,隨著其濃度的逐漸增加,MG-63細(xì)胞早期及晚期凋亡的所占的比例分別逐漸增加,總凋亡率逐步增加,HIF-1a 及 Survivin的表達(dá)逐漸減少。低氧環(huán)境是抑制MG-63細(xì)胞凋亡增加的重要因素之一,在低氧環(huán)境下NS-398可有效促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡,并隨濃度梯度而變化。結(jié)論：在低氧狀態(tài)下,骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡較在常氧狀態(tài)下顯著受到抑制,HIF-1a及Survivin表達(dá)均增加。在低氧狀態(tài)下,經(jīng)不同濃度NS-398處理后,MG-63細(xì)胞發(fā)生G0/G1期細(xì)胞周期阻滯,隨NS-398濃度升高可增加Go/G1期細(xì)胞比例,降低S、G2/M期細(xì)胞比例；隨著NS-398濃度的增加,細(xì)胞凋亡率增加,HIF-1α及Survivin的表達(dá)減少。低氧環(huán)境是抑制MG-63細(xì)胞凋亡增加的重要因素之一,在低氧環(huán)境下NS-398可有效促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡,并隨濃度梯度而變化。COX-2抑制劑NS-398可能是一種有前景的骨肉瘤化療藥物。
【關(guān)鍵詞】：骨肉瘤 低氧 凋亡
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R738.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文縮略詞釋義表10-14
• 前言與背景14-15
• 材料和方法15-22
• 結(jié)果22-27
• 討論27-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-38
• 綜述38-46
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷46-47
• 致謝47-48

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