造血干細胞可以產(chǎn)生所有譜系的血液細胞,它主要存在于骨髓內(nèi),骨髓壁龕可以為其提供靜息、增殖和分化所必需的調(diào)節(jié)信號。骨髓基質(zhì)細胞是骨髓的主要成分,越來越多的證據(jù)表明它是造血干細胞的“沉默伴侶”,可以分泌多種造血過程中所需的正負調(diào)控因子,發(fā)揮高效的調(diào)控作用,另一方面它也能為造血干細胞的增殖、分化與成熟構(gòu)筑良好的空間環(huán)境。它還可以分泌生長因子以促進克隆細胞生存、招募內(nèi)皮細胞及間充質(zhì)干細胞。黑色素瘤細胞黏附分子(MCAM)被認為是骨髓壁龕的標志物,也是骨髓基質(zhì)細胞命運的決策者。糖基化是存在較為廣泛的蛋白翻譯后修飾之一,與蛋白的表達、定位和半衰期密切相關(guān),還影響細胞的增殖或凋亡等。糖鏈由糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶共同作用產(chǎn)生。其中,N-乙酰氨基葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(MGAT3)負責將N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的β-1,4糖苷鍵連接到N-聚糖上的β-甘露糖上,形成平分型GlcNAc結(jié)構(gòu)。平分型GlcNAc可以抑制細胞之間以及細胞與胞外基質(zhì)之間的黏附從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,但其對于骨髓微環(huán)境以及其中的克隆細胞的影響尚未有深入研究。骨髓基質(zhì)細胞與惡性克隆細胞共培養(yǎng)的模型,常被用于研究骨髓微環(huán)境中基質(zhì)細胞與惡...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語對照表
第一章 緒論
    1.1 骨髓微環(huán)境
    1.2 骨髓微環(huán)境中的黏附分子MCAM
    1.3 糖基化修飾及平分型GlcNAc
    1.4 蛋白糖基化位點鑒定
    1.5 共培養(yǎng)模型及其應用
    1.6 高爾基體、溶酶體與蛋白加工
    1.7 立題根據(jù)與意義
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 試劑及培養(yǎng)基的配制
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細胞培養(yǎng)
        2.2.2 細胞中蛋白質(zhì)的提取
        2.2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡
        2.2.4 凝集素印跡
        2.2.5 免疫共沉淀
        2.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定
        2.2.7 細胞免疫熒光染色
        2.2.8 Edu標記檢測細胞增殖
        2.2.9 平分型GlcNAc的檢測
        2.2.10 RNA提取
        2.2.11 RT-PCR
        2.2.12 細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.13 蛋白在高爾基體及溶酶體中的定位檢測
        2.2.14 慢病毒濃縮
        2.2.15 原代骨髓基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染
        2.2.16 NHS-LC-Biotin生物素標記膜蛋白實驗
        2.2.17 小鼠骨髓基質(zhì)細胞分離與培養(yǎng)
        2.2.18 蛋白糖基化位點鑒定
        2.2.19 統(tǒng)計學分析實驗結(jié)果
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 臨床樣本中MGAT3、MCAM以及平分型GlcNAc的表達
        3.1.1 臨床樣本骨髓基質(zhì)細胞中MGAT3、平分型GlcNAc以及MCAM的表達
        3.1.2 MDS與對照組骨髓基質(zhì)細胞中MGAT3和MCAM的 m RNA表達水平
        3.1.3 小結(jié)
    3.2 共培養(yǎng)后骨髓基質(zhì)細胞中平分型GlcNAc修飾的變化
        3.2.1 與惡性克隆細胞共培養(yǎng)后HS27a細胞中平分型GlcNAc表達的變化
        3.2.2 與惡性克隆細胞共培養(yǎng)后HS5 細胞中平分型GlcNAc表達的變化
        3.2.3 小結(jié)
    3.3 基質(zhì)細胞中修飾平分型GlcNAc對惡性克隆細胞增殖的影響
        3.3.1 HS27a、HS27a-MGAT3 細胞對惡性克隆細胞增殖的影響
        3.3.2 HS5、HS5-sh MGAT3 細胞對惡性克隆細胞增殖的影響
        3.3.3 小結(jié)
    3.4 HS27a與 HS27a-MGAT3 細胞中NF-κB信號通路、CAF相關(guān)marker以及細胞因子的檢測
        3.4.1 HS27a與 HS27a-MGAT3 細胞中NF-κB信號通路的檢測
        3.4.2 HS27a與 HS27a-MGAT3 細胞中CAF相關(guān)marker的檢測
        3.4.3 HS27a與 HS27a-MGAT3 條件培養(yǎng)基中細胞因子的檢測
    3.5 過表達MGAT3 及沉默MGAT3 細胞株的構(gòu)建
        3.5.1 HS27a-Tet One-MGAT3 細胞株的構(gòu)建
        3.5.2 MSC-MGAT3、MSC-sh MGAT3 細胞株的構(gòu)建
        3.5.3 小結(jié)
    3.6 平分型GlcNAc影響MCAM表達的機制研究
        3.6.1 平分型GlcNAc修飾MCAM
        3.6.2 MCAM上N-糖基化修飾位點預測
        3.6.3 MCAM蛋白上平分型GlcNAc位點的鑒定
        3.6.4 生物素標記膜蛋白檢測MCAM在膜內(nèi)外的表達
        3.6.5 免疫熒光染色檢測HS27a和 HS27a-MGAT3中MCAM的表達
        3.6.6 小結(jié)
    3.7 小鼠模型驗證基質(zhì)細胞中過表達MGAT3對惡性克隆細胞增殖及生存期的影響
主要結(jié)論與展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間取得的科研成果
致謝



本文編號：3971906