發(fā)布時(shí)間：2024-04-08 20:40

　　研究背景骨肉瘤屬于原發(fā)于骨質(zhì)的惡性腫瘤的一種,好發(fā)于青少年人群,死亡率高。盡管采取手術(shù),輔助化療和放療等治療策略,但骨肉瘤病人的5年生存率仍很低。因此,尋找參與腫瘤發(fā)展的新分子可以為骨肉瘤患者的診治提供新策略。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一類產(chǎn)生于RNA前體的反向剪接過(guò)程的不含5’端帽和3’ polyA尾結(jié)構(gòu)的RNA。多種生命體中均可檢測(cè)到穩(wěn)定存在的circRNAs,并可通過(guò)miRNA調(diào)控下游mRNA表達(dá),在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用,已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Rac1),屬于RHO GTPases家族成員,研究報(bào)道其在多種惡性腫瘤中普遍上調(diào),且Rac1的激活與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),hsa-circ₀006602在骨肉瘤癌組織中表達(dá)上調(diào),并可能通過(guò)circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控參與骨肉瘤的進(jìn)展。本課題擬通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究探討hsa_circ₀006602/miR-224/Rac1調(diào)控軸對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。研究目的本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)骨肉瘤組織...

【文章頁(yè)數(shù)】：90 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞表
1 引言
2 材料
    2.1 組織
    2.2 細(xì)胞株和菌株
    2.3 動(dòng)物來(lái)源
    2.4 質(zhì)粒載體
    2.5 引物
    2.6 主要試劑耗材
    2.7 主要儀器設(shè)備
    2.8 主要實(shí)驗(yàn)試劑配制
        2.8.1 配置細(xì)胞完全培養(yǎng)基
        2.8.2 瓊脂糖凝膠制備
        2.8.3 配置磷酸鹽緩沖溶液
        2.8.4 配置0.25%EDTA胰蛋白酶
        2.8.5 配置凍存液
        2.8.6 配置TBST緩沖液
        2.8.7 5×轉(zhuǎn)膜緩沖液的配置
        2.8.8 5×電泳緩沖液的配置
        2.8.9 配置封閉液
        2.8.10 溶解miR-224 mimics、miR-224 inhibitor、hsa_circ₀006602 siRNA與NC
        2.8.11 配置LB液體培養(yǎng)基
        2.8.12 配置LB固體培養(yǎng)基
        2.8.13 配置過(guò)硫酸銨溶液
3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)骨肉瘤癌組織及其癌旁組織中hsa_circ₀006602、Rac1 mRNA和miR-224的表達(dá)水平
        3.1.1 提取骨肉瘤癌組織及其癌旁組織中總RNA
        3.1.2 hsa_circ₀006602與Rac1的cDNA合成與qRT-PCR反應(yīng)
        3.1.3 miR-224的cDNA合成與qRT-PCR反應(yīng)
    3.2 細(xì)胞操作方法
        3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)條件
        3.2.3 細(xì)胞傳代
        3.2.4 細(xì)胞凍存
    3.3 測(cè)序鑒定hsa_circ₀006602在骨肉瘤細(xì)胞中存在
        3.3.1 提取細(xì)胞中總RNA
        3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA
        3.3.3 人基因組DNA提取
        3.3.4 PCR擴(kuò)增
        3.3.5 瓊脂糖凝膠回收DNA片段
        3.3.6 T載體連接
        3.3.7 轉(zhuǎn)化
        3.3.8 藍(lán)白斑篩選
    3.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞與正常成骨細(xì)胞中hsa_circ₀006602、Rac1 mRNA和miR-224的表達(dá)水平
        3.4.1 提取細(xì)胞中總RNA
        3.4.2 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA
        3.4.3 細(xì)胞的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)
    3.5 免疫印記檢測(cè)Rac1在骨肉瘤癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)
        3.5.1 骨肉瘤組織總蛋白的提取
        3.5.2 配置SDS-PAGE膠
        3.5.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)步驟
    3.6 免疫印記檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞與hFOB1.19細(xì)胞中蛋白表達(dá)
        3.6.1 細(xì)胞中總蛋白的提取
        3.6.2 SDS-PAGE膠
        3.6.3 免疫印記實(shí)驗(yàn)
    3.7 MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.7.1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        3.7.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率
        3.7.3 轉(zhuǎn)染所用RNA序列
    3.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性
    3.9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲
    3.10 檢測(cè)細(xì)胞遷移(劃痕實(shí)驗(yàn))
    3.11 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)
    3.12 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)合
        3.12.1 提取基因組DNA
        3.12.2 hsa_circ₀006602與Rac1野生型和突變型載體構(gòu)建
        3.12.3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
    3.13 hsa_circ₀006602 siRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株獲得與篩選
        3.13.1 篩選濃度確定
        3.13.2 hsa_circ₀006602 siRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株鑒定
    3.14 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
    3.15 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.1 骨肉瘤中hsa_circ₀006602的篩選與結(jié)構(gòu)鑒定
        4.1.1 hsa_circ₀006602的環(huán)化過(guò)程
        4.1.2 hsa_circ₀006602的結(jié)構(gòu)鑒定
    4.2 骨肉瘤及癌旁組織中hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1的表達(dá)
    4.3 骨肉瘤細(xì)胞系和正常人成骨細(xì)胞系hFOB1.19中hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1的表達(dá)
    4.4 敲低hsa_circ₀006602對(duì)MG63細(xì)胞中hsa_circ₀006602、miR-224、Rac1的表達(dá)及增殖、侵襲、遷移能力的影響
    4.5 構(gòu)建裸鼠移植瘤模型檢測(cè)hsa_circ₀006602對(duì)骨肉瘤細(xì)胞皮下成瘤能力影響
    4.6 生物信息學(xué)分析hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1間關(guān)聯(lián)
    4.7 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1間匹配結(jié)合作用
        4.7.1 重組載體構(gòu)建
        4.7.2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4.8 轉(zhuǎn)染miR-224 mimics可致MG63細(xì)胞中Rac1表達(dá)下調(diào)
    4.9 回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在骨肉瘤細(xì)胞中存在hsa_circ₀006602/miR-224/Rac1網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)骨肉瘤的增殖、侵襲和遷移
5 討論
6 結(jié)論
7 參考文獻(xiàn)
綜述 circRNA的形成機(jī)制及與骨肉瘤的相關(guān)性研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝



本文編號(hào)：3948781