臨床前研究結(jié)果表明TNFα誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性。然而,臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在腫瘤治療過(guò)程中,TNFα治療誘發(fā)了顯著的全身性毒性,并且患者對(duì)TNFα的最大耐受劑量較低,這嚴(yán)重阻礙了TNFα從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。如何降低TNFα的毒副作用,如何在患者可忍受的劑量范圍內(nèi)提高TNFα的療效,這急需我們?nèi)ソ鉀Q。我們的研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn):在肝癌細(xì)胞中,TNFα能夠誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流,并呈劑量依賴性。文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca²⁺)水平的變化與多種細(xì)胞活動(dòng)密切相關(guān)。胞內(nèi)鈣離子的濃度能夠決定細(xì)胞“生”與“死”。我們研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TNFα誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。基于此,我們提出本課題的科學(xué)假說(shuō):TNFα誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流促進(jìn)細(xì)胞凋亡;通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞鈣離子攝入,放大TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;聯(lián)合應(yīng)用TNFα和鈣離子攝取藥物,能夠有效提高抗腫瘤藥物TNFα的腫瘤殺傷效果。【目的】本課題以肝細(xì)胞癌為研究對(duì)象,明確TNFα具有誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流的作用,探索TNFα誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究。【方法】1.利用Fura-2/AM活細(xì)胞染色,分析肝癌細(xì)胞胞漿鈣離子水平的變化...

【文章頁(yè)數(shù)】：116 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
中文摘要
ABSTRACT
前言
文獻(xiàn)回顧
第一部分 TNFΑ誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的作用研究
    1 材料
        1.1 研究對(duì)象
        1.2 主要試劑
        1.3 儀器耗材
    2 方法
        2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        2.2 細(xì)胞傳代
        2.3 細(xì)胞凍存
        2.4 細(xì)胞胞漿鈣離子染色(Fura-2/AM染料法)
        2.5 細(xì)胞胞漿鈣離子水平檢測(cè)
    3 結(jié)果
        3.1 TNFα誘導(dǎo)HCC細(xì)胞胞漿鈣離子水平升高
        3.2 TNFα誘導(dǎo)HCC細(xì)胞胞外鈣離子內(nèi)流
    4 討論
第二部分 TNFΑ誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流的機(jī)制研究
    1 材料
        1.1 研究對(duì)象
        1.2 主要試劑
        1.3 儀器耗材
    2 方法
        2.1 細(xì)胞胞漿鈣離子染色(Fura-2/AM染色法)
        2.2 細(xì)胞胞漿鈣離子水平檢測(cè)
        2.3 siRNA片段轉(zhuǎn)染
        2.4 real-timePCR檢測(cè)靶基因在肝癌細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平
        2.5 免疫印跡檢測(cè)特定蛋白表達(dá)水平
        2.6 免疫共沉淀
    3 結(jié)果
        3.1 qPCR和Westernblot檢測(cè)TNFR1和TNFR2在SNU739和HLF細(xì)胞中的表達(dá)水平
        3.2 siRNA片段靶向沉默TNFR1
        3.3 siRNA靶向沉默TNFR1對(duì)TNFR2的反饋調(diào)節(jié)
        3.4 沉默TNFR1對(duì)TNFα誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流的影響
        3.5 電壓型離子通道抑制劑對(duì)TNFα誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流的影響
        3.6 TRP通道抑制劑對(duì)TNFα誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流的影響
        3.7 qPCR檢測(cè)多種TRP通道分子的mRNA表達(dá)水平
        3.8 siRNA靶向沉默TRPM7
        3.9 沉默TRPM7對(duì)TNFα介導(dǎo)的胞外鈣離子內(nèi)流的影響
        3.10 TNFα激活TRPM7通道的機(jī)制研究
    4 討論
第三部分 TNFΑ誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用研究
    1 材料
        1.1 研究對(duì)象
        1.2 主要試劑
        1.3 儀器耗材
    2 方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 細(xì)胞胞漿鈣離子水平的檢測(cè)(Fura-2/AM)
        2.3 免疫印跡
        2.4 pcDNA3.1-PV質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.5 構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PV基因的肝癌細(xì)胞株質(zhì)
        2.6 siRNA片段的轉(zhuǎn)染
        2.7 裸鼠皮下成瘤
        2.8 裸鼠尾靜脈注射及腫瘤大小測(cè)量
        2.9 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
    3 結(jié)果
        3.1 BAPTA-AM螯合胞漿鈣離子抑制TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.2 過(guò)表達(dá)PV蛋白抑制TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.3 抑制TRP通道抑制TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.4 沉默TRPM7通道抑制TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：過(guò)表達(dá)PV蛋白抑制TNFα介導(dǎo)的抗腫瘤生長(zhǎng)作用
        3.6 過(guò)表達(dá)PV蛋白抑制抗腫瘤藥物TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.7 離子霉素誘導(dǎo)胞漿鈣離子水平升高促進(jìn)TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.8 IP3誘導(dǎo)胞漿鈣離子水平升高促進(jìn)TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.9 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：離子霉素聯(lián)合TNFα治療抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)
        3.10 離子霉素聯(lián)合TNFα顯著提高TNFα的腫瘤殺傷活性
    4 討論
第四部分 TNFΑ誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
    1 材料
        1.1 研究對(duì)象
        1.2 主要試劑
        1.3 儀器耗材
    2 方法
        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2 calpain酶活性檢測(cè)
        2.3 免疫印跡
        2.4 線粒體膜電位檢測(cè)(TMRM法)
        2.5 線粒體染色(Mito-TrackerRed)
        2.6 免疫熒光
    3 結(jié)果
        3.1 TNFα誘導(dǎo)鈣離子內(nèi)流激活calpain酶
        3.2 TNFα激活calpain促進(jìn)抗凋亡蛋白cIAP2,XIAP水解
        3.3 TNFα激活calpain促進(jìn)caspase3活化
        3.4 靶向沉默TNFR1對(duì)calpain酶活性的影響
        3.5 calpeptin抑制calpain阻斷TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
        3.6 過(guò)表達(dá)PV對(duì)TNFα介導(dǎo)的TNFα/Ca²⁺/calpain信號(hào)通路的影響
        3.7 離子霉素對(duì)TNFα介導(dǎo)的TNFα/Ca2+/calpain信號(hào)通路的影響
        3.8 TNFα處理對(duì)肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響
        3.9 TNFα處理對(duì)肝癌細(xì)胞細(xì)胞色素c亞定位的影響
        3.10 TNFα處理對(duì)Bcl-2家族分子轉(zhuǎn)位的影響
    4 討論
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果
致謝



本文編號(hào)：3940113