發(fā)布時間：2024-01-30 22:46

　　蛋白質(zhì)的泛素化修飾方式可以調(diào)控蛋白質(zhì)包括降解在內(nèi)的很多功能,其中包括USP8(Ubiquitin-specific protease 8,泛素特異性蛋白酶8)在內(nèi)的去泛素化酶是泛素化修飾的關鍵調(diào)節(jié)因素之一。CX43(Connexin 43,縫隙連接蛋白43)以及主要由其承擔的GJIC(gap junction intercellular communication,細胞縫隙連接通信)是細胞的基本蛋白分子和功能,對乳腺癌的轉(zhuǎn)移等很多生物學行為都有重要的調(diào)控作用。泛素化是CX43降解的主要觸發(fā)因素和降解途徑的選擇因素。因此,研究USP8對CX43的去泛素化的具體機制,以及調(diào)控其降解的方式,進而研究這種作用對于乳腺癌的轉(zhuǎn)移的影響,具有重要的基礎研究意義和臨床應用的潛在價值。本課題主要分兩部分,第一部分研究USP8對CX43的具體作用及機制。第二部分則著重研究USP8通過去泛素化對CX43功能的影響。在第一部分,我們首先通過胞內(nèi)胞外免疫共沉淀實驗,證實USP8和CX43直接結(jié)合。其次發(fā)現(xiàn)二者結(jié)合后,USP8對CX43有去泛素化作用。隨后研究發(fā)現(xiàn),這種去泛素化作用導致CX43的降解受到抑制。接下...

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【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 蛋白質(zhì)的泛素化修飾
        1.1.1 泛素
        1.1.2 泛素化及相關的酶
        1.1.3 泛素化修飾模式的多樣性及原因
        1.1.4 泛素化修飾模式和功能相關性
    1.2 細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解途徑和泛素化的關系
        1.2.1 泛素-蛋白酶體途徑
        1.2.2 自噬-溶酶體途徑
        1.2.3 內(nèi)體-溶酶體途徑
        1.2.4 三者的關系
            1.2.4.1 內(nèi)體和自噬
            1.2.4.2 蛋白酶體和自噬
    1.3 USP8
        1.3.1 USP8 的結(jié)構(gòu)
        1.3.2 USP8 的一般底物及功能
            1.3.2.1 EGFR 表皮生長因子受體家族
            1.3.2.2 中心體和V-SNARE蛋白
            1.3.2.3 趨化因子受體4
            1.3.2.4 其它的底物
        1.3.3 USP8 對泛素化酶的調(diào)節(jié)及相應的功能
        1.3.4 USP8 對內(nèi)體ESCRT組分的去泛素化作用及功能
        1.3.5 USP8 對自噬的組分的去泛素化作用及相應的功能
        1.3.6 USP8 的被調(diào)節(jié)
        1.3.7 USP8 在腫瘤的研究
    1.4 縫隙連接和CX43
        1.4.1 縫隙連接及縫隙連接蛋白
        1.4.2 CX43 的結(jié)構(gòu)
        1.4.3 CX43 的合成和調(diào)控
        1.4.4 CX43 的門控通訊功能及調(diào)控
        1.4.5 CX43 的非通訊功能
        1.4.6 CX43 的半通道功能
        1.4.7 CX43和GJ的降解和調(diào)控
            1.4.7.1 CX43 合成后的降解過程和調(diào)控因素概述
            1.4.7.2 泛素化酶對CX43 降解的調(diào)控研究
            1.4.7.3 去泛素化酶對CX43 降解的調(diào)控研究
            1.4.7.4 蛋白酶體途徑
            1.4.7.5 自噬和內(nèi)吞溶酶體途徑
        1.4.8 CX43 在腫瘤的研究情況
            1.4.8.1 CX43 抑制腫瘤細胞增殖
            1.4.8.2 CX43 對腫瘤細胞遷移侵襲的影響
            1.4.8.3 CX43 抑制腫瘤干細胞的干性
    1.5 CX43 在乳腺癌的研究現(xiàn)狀
        1.5.1 在乳腺發(fā)育表達情況
        1.5.2 在乳腺癌組織和細胞的表達情況
        1.5.3 對增殖和凋亡的影響
        1.5.4 對轉(zhuǎn)移的影響
            1.5.4.1 CX43 對乳腺癌轉(zhuǎn)移影響的體內(nèi)觀察性研究
            1.5.4.2 CX43 影響乳腺癌轉(zhuǎn)移的細胞和分子機制
        1.5.5 和乳腺癌干細胞的關系
        1.5.6 半通道的作用
        1.5.7 CX43/GJIC需要考慮的其它因素
        1.5.8 CX43/GJIC用做治療靶標的研究
    1.6 本論文的立題依據(jù)
第二章 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料和儀器
        2.1.1 實驗細胞株
        2.1.2 質(zhì)粒
            2.1.2.1 USP8 相關質(zhì)粒
            2.1.2.2 CX43 相關質(zhì)粒
            2.1.2.3 ubiquitin相關質(zhì)粒
            2.1.2.4 對照質(zhì)粒
        2.1.3 小鼠
        2.1.4 臨床標本
        2.1.5 細胞培養(yǎng)基及細菌培養(yǎng)平板
        2.1.6 主要實驗試劑和耗材
        2.1.7 主要實驗實驗儀器
        2.1.8 常用試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 細胞株的體外培養(yǎng)、傳代及鋪板
        2.2.3 細胞化學轉(zhuǎn)染
        2.2.4 慢病毒感染貼壁細胞
        2.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡Western blotting
        2.2.6 免疫熒光染色
        2.2.7 組織固定、脫水、包埋和切片
        2.2.8 HE染色
        2.2.9 免疫組化IHC染色
        2.2.10 BCA法測定蛋白濃度
        2.2.11 蛋白表達及His-Tag蛋白純化
        2.2.12 放線菌酮(CHX)蛋白半衰期檢測法
        2.2.13 免疫共沉淀
        2.2.14 體外泛素化
        2.2.15 體內(nèi)泛素化
        2.2.16 熒光染料轉(zhuǎn)移流式細胞檢測
        2.2.17 Transwell細胞遷移和侵襲實驗
        2.2.18 mammosphere實驗
        2.2.19 統(tǒng)計分析用spss軟件
第三章 USP8對CX43 的去泛素化作用
    3.1 證實USP8和CX43 在細胞內(nèi)直接結(jié)合
    3.2 USP8對CX43 有去泛素化作用,提高其穩(wěn)定性
        3.2.1 USP8對CX43 有去泛素化作用
            3.2.1.1 過表達USP8致CX43 泛素化程度下降
                3.2.1.1.1 體內(nèi)泛素化實驗
                3.2.1.1.2 體外泛素化實驗
            3.2.1.2 敲低USP8 表達致CX43 泛素化程度上升
        3.2.2 USP8對CX43 的去泛素化作用提高其蛋白含量
            3.2.2.1 USP8 過表達致細胞內(nèi)CX43 蛋白含量增加
            3.2.2.2 USP8 敲低致細胞內(nèi)CX43 蛋白含量減少
    3.3 USP8 保護CX43 免受自噬介導的降解
        3.3.1 CHX阻斷CX43 合成后,USP8對CX43 降解的影響
            3.3.1.1 MEF細胞的半衰期實驗
            3.3.1.2 MDA-MB-231 細胞的半衰期實驗
        3.3.2 蛋白降解阻滯劑探究USP8 保護CX43 免于降解的具體降解途徑
            3.3.2.1 在USP8 敲低MEF細胞的阻滯劑實驗
            3.3.2.2 在USP8 敲低MDA-MB-231 細胞的阻滯劑實驗
        3.3.3 BAF對 USP8 敲低細胞的CX43 降解的影響
            3.3.3.1 BAF對 USP8 敲低MEF細胞的CX43 降解的影響
            3.3.3.2 BAF對 USP8 敲低MDA-MB-231 細胞CX43 降解的影響
        3.3.4 Atg7 敲除對的USP8 敲低MEF細胞的CX43 降解的影響
    3.4 USP8 降低CX43 的多泛素化和多聚泛素化
        3.4.1 K63或K48 泛素化抗體檢測CX43的K63或K48 多聚泛素化
            3.4.1.1 USP8 過表達時CX43的K63或K48 多聚泛素化情況
            3.4.1.2 USP8 敲低CX43的K63-或K48 多聚泛素化情況
        3.4.2 Ub^k0 質(zhì)粒研究CX43 的單泛素化、多位點單泛素化情況
    3.5 臨床標本連續(xù)切片的免疫組化研究
    3.6 小結(jié)
第四章 USP8 通過去泛素化影響CX43 的功能
    4.1 USP8 敲低致MEFs細胞GJIC削弱
    4.2 USP8 敲低后乳腺癌細胞的干細胞特性的變化
    4.3 USP8 敲低后乳腺癌細胞遷移的變化
        4.3.1 USP8 敲低后乳腺癌細胞遷移能力的變化
        4.3.2 USP8 敲低后乳腺癌細胞遷移能力變化的rescue實驗
    4.4 小結(jié)
第五章 全文小結(jié)
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 研究展望
參考文獻
附錄一 縮略語
致謝
攻讀博士學位期間學術和科研成果



本文編號：3890496