�、蛐虲RISPR/Cas9系統(tǒng)通過sgRNA識別目標(biāo)基因組序列,介導(dǎo)Cas9對DNA進(jìn)行切割,從而引入DNA雙鏈斷裂（double-strand breaks, DSBs）.非同源末端結(jié)合（non-homologous end joining, NHEJ）方式修復(fù)DSBs易發(fā)生基因突變從而實現(xiàn)特定基因的敲除。腫瘤細(xì)胞需要有維持端粒長度的機(jī)制來實現(xiàn)無限分裂。研究表明約85%的腫瘤依賴端粒酶的激活,15%的腫瘤則依賴端粒的替代延長機(jī)制（alternative lengthening telomeres, ALT）通過同源重組的方式維持端粒長度。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞瘤、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)ATRX基因失活與端粒的替代延長機(jī)制緊密相關(guān)。為進(jìn)一步揭示ATRX在ALT激活中的作用和ATRX對腫瘤發(fā)生的作用,本課題利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立ATRX基因敲除的HeLa細(xì)胞系。通過Western-blot在蛋白水平鑒定ATRX的表達(dá)和Sanger測序在DNA水平鑒定ATRX基因序列突變,成功建立了ATRX基因敲除的HeLa細(xì)胞系。 

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
一 前言
    1.1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)
    1.2 ATRX基因與端粒的替代延長機(jī)制
二 實驗內(nèi)容
三 實驗內(nèi)容流程圖
四 實驗方法
    4.1 構(gòu)建識別ATRX基因目標(biāo)序列的sgRNA重組載體(pLenti-sgRNA-Lib)
    4.2 慢病毒滴度測定方法(流式細(xì)胞儀計數(shù)法)
    4.3 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)實驗方法
    4.4 細(xì)胞感染實驗方法
    4.5 HeLa單克隆細(xì)胞分選方法
    4.6 T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ(T7 Endonuclease I,T7E1)酶切實驗方法
    4.7 ATRX基因sgRNA切割位點Sanger測序
    4.8 BCA方法測定蛋白濃度
    4.9 Western-blot實驗方法
五 實驗儀器、試劑和材料
    5.1 質(zhì)粒載體
    5.2 感受態(tài)菌株
    5.3 細(xì)胞
    5.4 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
    5.5 PCR主要試劑
    5.6 Western-blot主要試劑
    5.7 主要試劑盒
    5.8 主要儀器設(shè)備
    5.9 主要溶劑配方
    5.10 5組ATRX基因sgRNA目標(biāo)序列
    5.11 根據(jù)5組ATRX基因SgRNA目標(biāo)序列設(shè)汁合成的SgRNA接頭序列
    5.12 T7E1實驗PCR擴(kuò)增ATRX目標(biāo)序列的引物
六 結(jié)果與分析
    6.1 sgRNA重組載體測序結(jié)果
    6.2 慢病毒顆粒滴度檢測結(jié)果
    6.3 sgRNA重組載體感染HeLa細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察照片
    6.4 T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)酶切實驗結(jié)果
    6.5 Western-blot鑒定ATRX蛋白表達(dá)水平的實驗結(jié)果
    6.6 編號#21的HeLa細(xì)胞株ATRX基因Sanger測序結(jié)果
七 討論
    7.1 關(guān)于ATRX基因靶序列的選擇
    7.2 識別ATRX基因目標(biāo)序列的sgRNA重組載體的構(gòu)建
    7.3 sgRNA重組慢病毒載體感染細(xì)胞
    7.4 T7E1實驗巧步鑒定5組SgRNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對ATRX目標(biāo)序列的切割效率
    7.5 Western-blot在蛋白水平鑒定ATRX敲除
    7.6 Sanger測序在DNA水平分析ATRX突變機(jī)制
    7.7 對進(jìn)一步研究的展望
八 參考文獻(xiàn)
綜述：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用
    參考文獻(xiàn)
綜述：ATRX基因與端粒的替代延長機(jī)制
    參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3651346