目的:肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）在全球癌癥相關死亡率的排名中位列第三位。肝細胞癌晚期易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復發(fā)及臨床耐藥且預后相對較差。盡管通過手術、放療、化療等手段在一定程度上能延緩疾病進展,但大多數(shù)患者隨著病情發(fā)展仍不能避免轉(zhuǎn)移及復發(fā)。因此,闡明肝細胞癌發(fā)生發(fā)展過程,明確其分子調(diào)節(jié)機制,探索肝細胞癌治療的針對性靶點具有極其重大的意義。長鏈非編碼RNA NEAT1（Nuclear enriched abundant transcript 1）被認為是一種新型的功能性非編碼RNA,是一組長度大于200個核苷酸的非編碼RNA,在腫瘤細胞物質(zhì)循環(huán)、能量攝取及代謝重編程等諸多過程中發(fā)揮不可替代的調(diào)控作用。但NEAT1調(diào)控肝癌細胞生命活動過程中的具體機制尚不明確。自噬是應激條件下細胞自我保護的重要方式,自噬水平適當提高有助于腫瘤細胞的生長及耐藥。本研究旨在探索NEAT1調(diào)控肝癌細胞自噬的機制及其對抗腫瘤藥物抵抗能力的影響,致力于提供更多的理論基礎來豐富肝細胞癌的發(fā)病機制和治療策略。研究方法:1、通過TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫... 

【文章來源】：中國醫(yī)科大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

在多種癌癥組織中NEAT1表達上調(diào)（a-c）TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果提示NEAT1在癌癥組織（肝癌、膽管癌、結(jié)腸癌）中與癌旁組織相比呈現(xiàn)高表達趨勢；（d）NEAT1在肝癌細胞系（HepG2、Huh7、Hep3B及SMMC-7721）

中國醫(yī)科大學碩士學位論文103.2過表達NEAT1增強了細胞對索拉菲尼的抵抗能力上述數(shù)據(jù)結(jié)果顯示NEAT1在肝癌組織及細胞系中異常表達且與預后不良相關。然而，目前研究尚不能明確NEAT1在肝癌細胞中的多種惡性調(diào)節(jié)過程及具體作用機制。為進一步明確NEAT1的細胞內(nèi)調(diào)控機制，我們使用NEAT1過表達載體構(gòu)建NEAT1過表達細胞系。構(gòu)建的細胞系通過PCR進行了轉(zhuǎn)染后表達的測定，轉(zhuǎn)染后NEAT1的表達水平在兩種細胞系中分別提高了45倍和55倍（圖2a，2b），隨后以pcDNA3.1為陰性對照組，使用NEAT1過表達細胞系通過CCK8實驗檢測細胞活力評估細胞生長情況（圖2c，2d）。結(jié)果提示pcDNA3.1-NEAT1組降低了索拉菲尼對腫瘤細胞的生長抑制效應（P<0.05）。劃痕實驗證明pcDNA-3.1-NEAT1組索拉菲尼處理條件下的HepG2和Huh7細胞的遷移能力增強（圖2e，2f）。除此之外，NEAT1表達提高后增強了索拉菲尼處理條件下的HepG2和Huh7細胞的集落形成能力（圖2g）。以上實驗結(jié)果證明了NEAT1可能參與調(diào)控肝癌臨床耐藥的過程。圖2.索拉菲尼的細胞抑制作用可被NEAT1調(diào)節(jié)（a-b）NEAT1在HepG2和Huh7細胞系中的轉(zhuǎn)染后表達水平；（c-d）HepG2和Huh7細胞系中細胞活力的測定（CCK8實驗）；（e-f）兩種細胞系中不同處理因素下細胞遷移能力（HepG2和Huh7）；（g）克隆形成實驗評估細胞增殖能力。*P<0.05；**P<0.01。

中國醫(yī)科大學碩士學位論文113.3NEAT1促進肝癌細胞自噬自噬是細胞內(nèi)一個進化高度保守的物質(zhì)代謝循環(huán)過程，自噬運送貨物使其被降解可產(chǎn)生多種能量物質(zhì)（如乳酸、氨基酸等）可以回收利用以維持自身生長。近年來，大量的研究都集中研究了長鏈非編碼RNA對藥物抵抗的調(diào)節(jié)，但其調(diào)控藥物抵抗過程的分子機制尚不能完全明確。目前普遍認為自噬是介導細胞耐藥的重要環(huán)節(jié)和關鍵調(diào)控過程。在本次實驗過程中，我們擬深入探究NEAT1在HCC細胞自噬過程的調(diào)控方式。通過Westernblot實驗檢測過表達NEAT1細胞系的LC3表達情況，評價自噬的激活或抑制。Westernblot實驗發(fā)現(xiàn)在HepG2及Huh7的pcDNA3.1-NEAT1組中LC3II/LC3I比例與pcDNA3.1組相比較明顯增加（圖3a，3b）。為了進一步判斷自噬的激活，我們使用免疫熒光技術檢測了LC3表達，結(jié)果提示在兩種細胞中LC3表達分別增加5.1倍和4.2倍（圖3c）。此外投射電鏡顯示自噬小體明顯積累（圖3d）。這些結(jié)果都提示了自噬小體增加及自噬流的激活。圖3.NEAT1促進HCC細胞自噬（a-b）HepG2和Huh7細胞系中過表達NEAT1后Westernblot實驗評估自噬水平；（c）免疫熒光標記LC3蛋白檢測自噬通量（左側(cè)為pcDNA3.1，右側(cè)圖為pcDNA3.1-NEAT1）；（d）透射電鏡觀測自噬小體情況（左側(cè)為pcDNA3.1，右側(cè)圖為pcDNA3.1-NEAT1）。*P<0.05。

【參考文獻】：
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