發(fā)布時(shí)間：2021-10-29 01:53

　　目的:肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）在全球癌癥相關(guān)死亡率的排名中位列第三位。肝細(xì)胞癌晚期易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及臨床耐藥且預(yù)后相對(duì)較差。盡管通過(guò)手術(shù)、放療、化療等手段在一定程度上能延緩疾病進(jìn)展,但大多數(shù)患者隨著病情發(fā)展仍不能避免轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。因此,闡明肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程,明確其分子調(diào)節(jié)機(jī)制,探索肝細(xì)胞癌治療的針對(duì)性靶點(diǎn)具有極其重大的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1（Nuclear enriched abundant transcript 1）被認(rèn)為是一種新型的功能性非編碼RNA,是一組長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA,在腫瘤細(xì)胞物質(zhì)循環(huán)、能量攝取及代謝重編程等諸多過(guò)程中發(fā)揮不可替代的調(diào)控作用。但NEAT1調(diào)控肝癌細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中的具體機(jī)制尚不明確。自噬是應(yīng)激條件下細(xì)胞自我保護(hù)的重要方式,自噬水平適當(dāng)提高有助于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及耐藥。本研究旨在探索NEAT1調(diào)控肝癌細(xì)胞自噬的機(jī)制及其對(duì)抗腫瘤藥物抵抗能力的影響,致力于提供更多的理論基礎(chǔ)來(lái)豐富肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制和治療策略。研究方法:1、通過(guò)TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫(kù)... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

在多種癌癥組織中NEAT1表達(dá)上調(diào)（a-c）TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果提示NEAT1在癌癥組織（肝癌、膽管癌、結(jié)腸癌）中與癌旁組織相比呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)；（d）NEAT1在肝癌細(xì)胞系（HepG2、Huh7、Hep3B及SMMC-7721）

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文103.2過(guò)表達(dá)NEAT1增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的抵抗能力上述數(shù)據(jù)結(jié)果顯示NEAT1在肝癌組織及細(xì)胞系中異常表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)。然而，目前研究尚不能明確NEAT1在肝癌細(xì)胞中的多種惡性調(diào)節(jié)過(guò)程及具體作用機(jī)制。為進(jìn)一步明確NEAT1的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控機(jī)制，我們使用NEAT1過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建NEAT1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。構(gòu)建的細(xì)胞系通過(guò)PCR進(jìn)行了轉(zhuǎn)染后表達(dá)的測(cè)定，轉(zhuǎn)染后NEAT1的表達(dá)水平在兩種細(xì)胞系中分別提高了45倍和55倍（圖2a，2b），隨后以pcDNA3.1為陰性對(duì)照組，使用NEAT1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力評(píng)估細(xì)胞生長(zhǎng)情況（圖2c，2d）。結(jié)果提示pcDNA3.1-NEAT1組降低了索拉菲尼對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)（P<0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)證明pcDNA-3.1-NEAT1組索拉菲尼處理?xiàng)l件下的HepG2和Huh7細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)（圖2e，2f）。除此之外，NEAT1表達(dá)提高后增強(qiáng)了索拉菲尼處理?xiàng)l件下的HepG2和Huh7細(xì)胞的集落形成能力（圖2g）。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了NEAT1可能參與調(diào)控肝癌臨床耐藥的過(guò)程。圖2.索拉菲尼的細(xì)胞抑制作用可被NEAT1調(diào)節(jié)（a-b）NEAT1在HepG2和Huh7細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染后表達(dá)水平；（c-d）HepG2和Huh7細(xì)胞系中細(xì)胞活力的測(cè)定（CCK8實(shí)驗(yàn)）；（e-f）兩種細(xì)胞系中不同處理因素下細(xì)胞遷移能力（HepG2和Huh7）；（g）克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞增殖能力。*P<0.05；**P<0.01。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文113.3NEAT1促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬自噬是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)進(jìn)化高度保守的物質(zhì)代謝循環(huán)過(guò)程，自噬運(yùn)送貨物使其被降解可產(chǎn)生多種能量物質(zhì)（如乳酸、氨基酸等）可以回收利用以維持自身生長(zhǎng)。近年來(lái)，大量的研究都集中研究了長(zhǎng)鏈非編碼RNA對(duì)藥物抵抗的調(diào)節(jié)，但其調(diào)控藥物抵抗過(guò)程的分子機(jī)制尚不能完全明確。目前普遍認(rèn)為自噬是介導(dǎo)細(xì)胞耐藥的重要環(huán)節(jié)和關(guān)鍵調(diào)控過(guò)程。在本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們擬深入探究NEAT1在HCC細(xì)胞自噬過(guò)程的調(diào)控方式。通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)NEAT1細(xì)胞系的LC3表達(dá)情況，評(píng)價(jià)自噬的激活或抑制。Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在HepG2及Huh7的pcDNA3.1-NEAT1組中LC3II/LC3I比例與pcDNA3.1組相比較明顯增加（圖3a，3b）。為了進(jìn)一步判斷自噬的激活，我們使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)了LC3表達(dá)，結(jié)果提示在兩種細(xì)胞中LC3表達(dá)分別增加5.1倍和4.2倍（圖3c）。此外投射電鏡顯示自噬小體明顯積累（圖3d）。這些結(jié)果都提示了自噬小體增加及自噬流的激活。圖3.NEAT1促進(jìn)HCC細(xì)胞自噬（a-b）HepG2和Huh7細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)NEAT1后Westernblot實(shí)驗(yàn)評(píng)估自噬水平；（c）免疫熒光標(biāo)記LC3蛋白檢測(cè)自噬通量（左側(cè)為pcDNA3.1，右側(cè)圖為pcDNA3.1-NEAT1）；（d）透射電鏡觀測(cè)自噬小體情況（左側(cè)為pcDNA3.1，右側(cè)圖為pcDNA3.1-NEAT1）。*P<0.05。

【參考文獻(xiàn)】：
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