研究背景與目的結直腸癌（Colorectal cancer,CRC）是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一,據(jù)報道全球每年CRC新發(fā)病例高達136萬,死亡病例約達69萬,嚴重危害人類健康。尋找結直腸癌發(fā)生發(fā)展的關鍵分子及其相互關系,進一步闡明結直腸癌的發(fā)病機制具有重要的意義。結直腸癌發(fā)病隨著年齡的增長,發(fā)病風險增加。近年研究發(fā)現(xiàn)細胞衰老可能影響周圍微環(huán)境促進腫瘤的發(fā)生。該微環(huán)境是由成纖維細胞、內皮細胞、免疫細胞和腫瘤周圍的細胞外基質等共同構成的復雜網(wǎng)絡。Klotho是由Kuro-o等在1997年發(fā)現(xiàn)的一種衰老相關多功能蛋白,其在生物整體抗衰老和延長壽命方面的作用廣受關注。Klotho基因表達下降與壽命縮短、動脈硬化、心腦血管等疾病的發(fā)生相關。近年來人們發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤組織中也存在Klotho低表達現(xiàn)象,提示Klotho基因可能參與腫瘤調控。我們前期利用基因芯片篩選,發(fā)現(xiàn)Klotho基因受到表觀遺傳調控,在結腸癌細胞中低表達與啟動子DNA高甲基化有關。本研究將進一步闡明Klotho在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的臨床價值和重要生物學功能,探討Klotho對間質細胞衰老和衰老相關分泌表型的表達調控和作用機制... 

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圖１．１結直腸癌配對組織中Ｋｌｏｔｈｏ免疫組化鏡下表現(xiàn)及評分??注：放大倍數(shù)：Ａ，?Ｂ：光學顯微鏡２０〇ｘ??

部位主要在間質細胞中，在結直腸上皮細胞中也有一定程度的表達。染色陽性呈??棕黃色顆粒狀，不同的組織中染色程度不同，提示表達的強度不同。與對應的癌??旁配對組織相比，Ｋｌｏｔｈｏ在結直腸癌組織中染色明顯變淺，陽性率降低（圖１．１Ａ??和Ｂ）；免疫組化Ｋｌｏｔｈｏ表達評分統(tǒng)計結果顯示結直腸癌組織評分（２．６５土２．６１）??顯著低于癌旁配對組織（４．８８±４．２３）（圖１．１Ｃ）。??Ａ?Ｂ?Ｃ??Ｖ?■：丨??＾?□?Ｔ??Ｊ｜?，ｒ－?，?■??Ａｄｊａｃｅｎｔ?ｎｏｒｍａｌ?Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ?ｃａｎｃｅｒ?〇Ｊ?＇?＇???Ｎｏｒｍａｌ?Ｔｕｍｏｕｒ??圖１．１結直腸癌配對組織中Ｋｌｏｔｈｏ免疫組化鏡下表現(xiàn)及評分??注：放大倍數(shù)：Ａ，?Ｂ：光學顯微鏡２０〇ｘ??２．３?Ｋｌｏｔｈｏ蛋白表達水平與結直腸癌患者各臨床病理參數(shù)之間的相關性??我們進一步對Ｋｌｏｔｈｏ蛋白的表達情況與患者的臨床病理資料進行了相關性分??１１??

兩種常見細胞［３６’３７］。在本部分研究中，我們構建這兩種細胞的復制性細胞衰老模??型，發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)變平，體積變大以及ＳＡ－Ｐ－ｇａｌ陽性染色增加提示了這兩種細胞??隨著傳代過程而出現(xiàn)了衰老（圖２．１Ａ和圖２．２Ａ）。我們還運用目前廣泛認可的ＤＮＡ??損傷誘導的體外衰老細胞模型來進一步驗證，分別以阿霉素５０ｎｍｏｌ／Ｌ和８０ｎｍｏｌ／Ｌ??處理年輕ＨＵＶＥＣ和ＷＩ－３８細胞，藥物誘導的實驗組中ＳＡ－ｐ－ｇａｌ陽性細胞比例較??未加藥處理組明顯上升（圖２．１Ａ、Ｂ和圖２．２Ａ、Ｂ）。實時熒光定量ＰＣＲ技術和??Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ方法檢測上述細胞中的衰老標志分子Ｐ５３、Ｐ２１的表達水平，結果發(fā)??現(xiàn)：隨著細胞的傳代，Ｐ２１、Ｐ５３的表達明顯上升；相比于對照組，藥物誘導的實??驗組中Ｐ２１、Ｐ５３的表達水平亦顯著升高（圖２．１Ｃ和Ｄ、圖２．２Ｃ和Ｄ）。本研究??成功構建了?ＨＵＶＥＣ、ＷＩ－３８兩種細胞的兩種衰老模型（復制性和阿霉素誘導的衰??老模型）。??２．１．２?Ｋｌｏｔｈｏ對細胞衰老的影響??Ｋｌｏｔｈｏ是一個衰老相關蛋白，Ｋｌｏｔｈｏ基因缺陷的小鼠會出現(xiàn)一系列與人類衰??老相似的行為和病理變化［８］。我們提取了年輕的和衰老的（包括復制性衰老和阿霉??素誘導衰老）ＨＵＶＥＣ和ＷＩ－３８細胞的總ＲＮＡ和蛋白，結果發(fā)現(xiàn)隨著細胞衰老，??Ｋｌｏｔｈｏ的ｍＲＮＡ和蛋白水平均下降，提示Ｋｌｏｔｈｏ與細胞衰老相關（圖２．１Ｃ和Ｄ??和圖２．２Ｃ和Ｄ）。??我們利用人重組Ｋｌｏｔｈｏ蛋白預處理上述兩種年輕細胞后再予阿霉素誘導衰??老。結果發(fā)現(xiàn)

【參考文獻】：
期刊論文
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