發(fā)布時間：2021-08-18 07:12

　　研究背景和目的:結(jié)直腸癌（CRC）是全球發(fā)病率第三的惡性腫瘤,而腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要影響因素。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族及其受體被認(rèn)為是血管生成過程中最重要的調(diào)控因子。然而,臨床上抗VEGF/VEGFR治療的臨床療效并不理想,關(guān)于腫瘤血管生成的機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明。方法:從8對非轉(zhuǎn)移性和轉(zhuǎn)移性人結(jié)直腸癌（CRC）組織基因表達(dá)譜的微陣列數(shù)據(jù)中篩選出Dickkopf相關(guān)蛋白2（DKK2）,并通過熒光定量PCR（qRT-PCR）、western blot技術(shù)檢測新鮮結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中DKK2的表達(dá)水平。免疫熒光組織化學(xué)染色（IHC）檢測CRC組織中DKK2的表達(dá),分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。轉(zhuǎn)染或干擾DKK2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá),應(yīng)用CCK8細(xì)胞增殖實驗、劃痕愈合實驗、transwell遷移實驗、裸鼠皮下瘤模型觀察DKK2對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外生長及轉(zhuǎn)移的影響。雞胚尿囊膜（CAM）實驗和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）小管形成實驗分別用于體外和體內(nèi)血管生成的研究。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定培養(yǎng)基中的乳酸和葡萄糖的濃度。通過免疫共沉淀實驗、免疫熒光共聚焦實驗... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：123 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１－４：免疫組化顯示ＣＲＣ組織（Ｔ）及鄰近正常黏膜（Ｎ）中ＤＫＫ２蛋白的表達(dá)情況，和ｎｍＣＲＣ??和ｍＣＲＣ組織中ＤＫＫ２蛋白的表達(dá)

進(jìn)行?Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ?生存分析。以?ＤＫＫ２??在結(jié)直腸癌組織屮表達(dá)水平的中位數(shù)為分界點，將３５１例結(jié)直腸癌患者組織分??為ＤＫＫ２高表達(dá)組和Ｄ１ＣＫ２低表達(dá)組。分析結(jié)采顯示：ＤＫＫ２的表達(dá)水平與患??者的性別和年齡沒有明顯相關(guān)性（Ｐ＞〇．０５）。而ＤＫＫ２與腫瘤原發(fā)范圍、淋巴??結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床分期呈正相關(guān)。另外，我們還分析了病人的生存時間??包拈ＤＫＦＣ２高表達(dá)組和ＤＫＫ２低表達(dá)組，并制作生存曲線。發(fā)現(xiàn)高表達(dá)ＤＫＫ２??患者生存時間明顯短ｒＤＫＫ２表達(dá)較低的患者（圖１－５Ｂ；?Ｐ＜０．００１）。提示ＤＫＫ２??高表達(dá)與結(jié)貞腸癌患者＋良顱后密Ｗ扣關(guān)。??Ａ．?〇＞?ｐ＝ｏ．ｏｏｉ?Ｂ?ＧＳＥ８７２１１－ＧＰＬ１３４９７??｜?２５１?Ｉ?：?１??虧?Ｌｏｗ?ＤＫＫ２??－Ｄ?２０－?■?▲?ＨｉｇｈＤＫＫ２??ｆ?１５－?｜??１１〇．?！??Ｅ?？ｙ?１０．５－?Ｘ??１?５?？？?ｗ?Ｐ＜０．００１??ＪＳ?０?＿．??空?ｎｍＣＲＣ?ｍＣＲＣ?Ｓ??（ｎ＝８＞?（ｎ＝８）?〇?５０?ｉ〇〇?１５０??Ｍｏｎｔｈｓ??圖１－５：在ｎｍＣＲＣ和ｍＣＲＣ組織中ＤＫＫ２?ＲＮＡ水平表達(dá)情況。??具有不同丨）ＫＫ２表達(dá)水平的ＣＲＣ患者的Ｋａｐ丨ａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線和單因素變量分析。??（Ａ）ＤＫＫ２?ＲＮＡ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｉｎ?ｎｍＣＲＣ?ａｎｄ?ｍＣＲＣ?ｔｉｓｓｕｅｓ．??１９??

響，因此，主要參考蛋白免疫印??記實驗結(jié)果篩選ＤＫＫ２在具有高轉(zhuǎn)移潛能的ＳＷ６２０和ＬＳ１７４Ｔ細(xì)胞進(jìn)行ＤＫＫ２??的敲低處理，而低表達(dá)ＤＫＫ２的ＲＫＯ和ＨＣＴ１１６細(xì)胞則用于后續(xù)實驗的過表??達(dá)處理。在此我們猜測ＤＫＫ２高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。??Ａ?｜?３－｜??１２－?－?＾?－?丁??ｉ?ＶＩＩ＇廠會ｉ？暑??巧丨％?＿國＿??？??ＤＫＫ２?＿？＿？?一。｜麵丨Ｉ?丨＿丨丨丨丨丨＂丨丨，：ｍｍｊ＾，一??Ｐ－ａｃｔｉｎ?ｍｍｍ?ｍｍｍ?ｍｍ?ｍｍ??圖２－１：在ＮＣＭ４６０和７種不同的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中檢測到ＤＫＫ２?ｍＲＮＡ和蛋白的表達(dá)。??每條代表平均值士ＳＤ（ｉ它３）。??（Ａ）?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＤＫＫ２?ｍＲＮＡ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｉｎ?ＮＣＭ４６０?ａｎｄ?ｓｅｖｅｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ?ｃａｎｃｅｒ??ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ．?Ｅａｃｈ?ｂａｒ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ｔｈｅ?ｍｅａｎ?±?ＳＤ?（ｎ＞３）．??（Ｂ）?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＤＫＫ２?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｉｎ?ＮＣＭ４６０?ａｎｄ?ｅｉｇｈｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ?ｃａｎｃｅｒ??ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ．??２．３．２構(gòu)建ＤＫＫ２穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株??通過山東維真公司成功構(gòu)建ＤＫＫ２過表達(dá)腺病毒，載體帶有卡那霉素抗性??和熒光素酶報告基因，經(jīng)測序結(jié)果鑒定插入序列正確。首先用病毒感染ＤＫＫ２??蛋白含量較低的結(jié)直腸癌細(xì)胞系ＨＣＴ１１６和ＲＫＯ，通過卡那霉素進(jìn)行篩選，未??感染或感染率較低的細(xì)胞出現(xiàn)死亡。通過熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá)較

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]A Brief Review on the Mechanisms of miRNA Regulation[J]. Yimei Cai,Xiaomin Yu,Songnian Hu,and Jun Yu Key Laboratory of Genome Sciences and Information,Beijing Institute of Genomics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100029,China..  Genomics Proteomics & Bioinformatics. 2009(04)



本文編號：3349450