Engrailed-2蛋白單克隆抗體的制備與鑒定及其在前列腺癌中的表達
發(fā)布時間：2021-08-07 10:52
目 的1.人體前列腺癌和前列腺增生組織中Engrailed-2基因mRNA的表達2.Engrailed-2蛋白單克隆抗體的制備與鑒定3.人體前列腺癌和前列腺增生組織中Engrailed-2蛋白的表達方 法分別收集臨床病理確診的前列腺癌組織標本20例,前列腺增生組織標本25例,使用實時熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR）檢測人體前列腺癌和前列腺增生組織標本中Engrailed-2基因mRNA的表達。將Homeobox Engrailed-2基因（NM001427.3）C末端114aa序列連接到基因表達載體pET-28a,轉染大腸桿菌,表達純化EN2重組蛋白。用該EN2重組蛋白免疫小鼠,使用雜交瘤技術篩選表達EN2單克隆抗體的細胞株,使用ELISA、Western Blotting、免疫組化等方法鑒定抗體性質(zhì),將陽性細胞株接種到小鼠腹腔進行EN2單克隆抗體的大量制備。隨后,使用EN2單克隆抗體對人體前列腺癌和前列腺增生組織進行免疫組化,分析EN2蛋白在人體前列腺癌組織和前列腺增生組織中的表達差異。結 果20例人體前列腺...
【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：62 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖３．?３．?２?９６孔酶標板測定抗體效價示意圖??Ｂ、Ｃ、Ｄ三行用于血清效價測定
?３方法???（４）電泳：以８０Ｖ的電壓進行濃縮膠電泳，待蛋白樣品電泳至濃縮膠分離??膠交界處，調(diào)整電泳條件為１２０Ｖ，繼續(xù)電泳至蛋白樣品距ＳＤＳ－ＰＡＧＥ膠下方１??厘米左右，停止電泳；??（５）半干式電轉：將濾紙剪裁為５ｃｍｘ８ｃｍ大小，疊加在一起（１２張一沓），??放入電轉液中浸潤，電轉槽底部涂抹上少量電轉液，潤濕即可，按照圖３．５．３所??示順序分別放置厚濾紙，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白膠和ＮＣ膜，注意正負極方向且正負極??的厚濾紙不能直接接觸，保證電流經(jīng)正極—厚濾紙￣？ＮＣ膜—ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白膠??—厚濾紙—負極穿過整個系統(tǒng)。定流２５ｍＡ，室溫電轉２小時；??（６）封閉：配置５０ｍｌ的５％脫脂奶粉，將整片ＮＣ膜浸沒入脫脂奶粉封閉??液中，４°Ｃ過夜孵育；??（７）加一抗：將純化好的ＥＮ２單抗稀釋為統(tǒng)一的１００以／ｍＬ，在５ｍＬＥＰ管??中各配置３?ｍＬ—抗，在ＮＣ膜下方編號，將各個泳道剪裁開，分別放入不同的??一抗中，室溫搖床孵育１小時；??（８）加二抗：棄去ＥＰ管中的一抗，加入０．１％的：ＰＢＳＴ室溫搖床５ｍｉｎ，洗??５遍，配置１：１００００山羊抗小鼠ＩｇＧ抗體－ＨＲＰ二抗，ＮＣ膜條帶放入其中，室??溫搖床孵育１小時；??（９）顯色：將ＮＣ膜條帶取出，使用０．１％的ＰＢＳＴ室溫搖床５ｍｉｎ，洗１０??遍。按照顯色液Ａ液：Ｂ液＝１：１配置，滴加到ＮＣ膜條帶上，室溫５－１０ｍｉｎ后，??濾紙吸干顯色液，保鮮膜上下均勻覆蓋；??（１０）暗室曝光顯影。??示意圖３．?５．?３?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ半干式電轉示意圖??３．５．４?ＥＮ２單克隆抗體與前列腺癌細胞系ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａｐ細胞總蛋
５?倍，最大為?３１．４２?倍，且可以看出，組織?１?（３０．８６）、３?（２３．４２）、６?（３１．４２）、??２０?（２３．８８）的ＥＮ２基因表達更高。??２０例前列腺癌組織標本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??４０－??３０－?ｉｊｆａ?置??Ｉ?Ｉ?ｊ?Ａ??〇?２〇－?｜??〇．ｊ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－ｇＬＴ?ｇｆＴｉｑｌ?ＴＪ?ｐ｜Ｄｌ－Ｔ－〇ｊ－Ｔ－??ＢＰＨ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０??前列腺癌組織標本??圖４．?１?２０例前列腺癌和２５例前列腺增生組織標本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??采用２￣Ａ?ＡＣｔ法進行計算，該數(shù)值大于１即表明該前列腺癌組織中ＥＮ２基因的表達高于??前列腺增生組。??４．２?Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ－２重組蛋白的原核表達??選取?ＥｎｇｒａｉｌｅｄＨｏｍｅｏｂｏｘ２?基因（ＮＭ＿００１４２７．３）的?Ｃ?末端?１１４ａａ?序列，將??２３??
【參考文獻】：
期刊論文
[1]中國前列腺癌的流行病學概述和啟示[J]. 葉定偉,朱耀. 中華外科雜志. 2015 (04)
[2]中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析[J]. 韓蘇軍,張思維,陳萬青,李長嶺. 臨床腫瘤學雜志. 2013(04)
[3]中國部分市縣前列腺癌發(fā)病趨勢比較研究[J]. 李鳴,張思維,馬建輝,陳萬青,那彥群. 中華泌尿外科雜志. 2009 (06)
[4]前列腺癌的流行病學特征及晚期一線內(nèi)分泌治療分析[J]. 馬春光,葉定偉,李長嶺,周芳堅,姚旭東,張世林,戴波,張海梁,朱耀,沈益君. 中華外科雜志. 2008 (12)
本文編號：3327666
【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：62 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
圖３．?３．?２?９６孔酶標板測定抗體效價示意圖??Ｂ、Ｃ、Ｄ三行用于血清效價測定
?３方法???（４）電泳：以８０Ｖ的電壓進行濃縮膠電泳，待蛋白樣品電泳至濃縮膠分離??膠交界處，調(diào)整電泳條件為１２０Ｖ，繼續(xù)電泳至蛋白樣品距ＳＤＳ－ＰＡＧＥ膠下方１??厘米左右，停止電泳；??（５）半干式電轉：將濾紙剪裁為５ｃｍｘ８ｃｍ大小，疊加在一起（１２張一沓），??放入電轉液中浸潤，電轉槽底部涂抹上少量電轉液，潤濕即可，按照圖３．５．３所??示順序分別放置厚濾紙，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白膠和ＮＣ膜，注意正負極方向且正負極??的厚濾紙不能直接接觸，保證電流經(jīng)正極—厚濾紙￣？ＮＣ膜—ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白膠??—厚濾紙—負極穿過整個系統(tǒng)。定流２５ｍＡ，室溫電轉２小時；??（６）封閉：配置５０ｍｌ的５％脫脂奶粉，將整片ＮＣ膜浸沒入脫脂奶粉封閉??液中，４°Ｃ過夜孵育；??（７）加一抗：將純化好的ＥＮ２單抗稀釋為統(tǒng)一的１００以／ｍＬ，在５ｍＬＥＰ管??中各配置３?ｍＬ—抗，在ＮＣ膜下方編號，將各個泳道剪裁開，分別放入不同的??一抗中，室溫搖床孵育１小時；??（８）加二抗：棄去ＥＰ管中的一抗，加入０．１％的：ＰＢＳＴ室溫搖床５ｍｉｎ，洗??５遍，配置１：１００００山羊抗小鼠ＩｇＧ抗體－ＨＲＰ二抗，ＮＣ膜條帶放入其中，室??溫搖床孵育１小時；??（９）顯色：將ＮＣ膜條帶取出，使用０．１％的ＰＢＳＴ室溫搖床５ｍｉｎ，洗１０??遍。按照顯色液Ａ液：Ｂ液＝１：１配置，滴加到ＮＣ膜條帶上，室溫５－１０ｍｉｎ后，??濾紙吸干顯色液，保鮮膜上下均勻覆蓋；??（１０）暗室曝光顯影。??示意圖３．?５．?３?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ半干式電轉示意圖??３．５．４?ＥＮ２單克隆抗體與前列腺癌細胞系ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａｐ細胞總蛋
５?倍，最大為?３１．４２?倍，且可以看出，組織?１?（３０．８６）、３?（２３．４２）、６?（３１．４２）、??２０?（２３．８８）的ＥＮ２基因表達更高。??２０例前列腺癌組織標本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??４０－??３０－?ｉｊｆａ?置??Ｉ?Ｉ?ｊ?Ａ??〇?２〇－?｜??〇．ｊ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－ｇＬＴ?ｇｆＴｉｑｌ?ＴＪ?ｐ｜Ｄｌ－Ｔ－〇ｊ－Ｔ－??ＢＰＨ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０??前列腺癌組織標本??圖４．?１?２０例前列腺癌和２５例前列腺增生組織標本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??采用２￣Ａ?ＡＣｔ法進行計算，該數(shù)值大于１即表明該前列腺癌組織中ＥＮ２基因的表達高于??前列腺增生組。??４．２?Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ－２重組蛋白的原核表達??選取?ＥｎｇｒａｉｌｅｄＨｏｍｅｏｂｏｘ２?基因（ＮＭ＿００１４２７．３）的?Ｃ?末端?１１４ａａ?序列，將??２３??
【參考文獻】：
期刊論文
[1]中國前列腺癌的流行病學概述和啟示[J]. 葉定偉,朱耀. 中華外科雜志. 2015 (04)
[2]中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析[J]. 韓蘇軍,張思維,陳萬青,李長嶺. 臨床腫瘤學雜志. 2013(04)
[3]中國部分市縣前列腺癌發(fā)病趨勢比較研究[J]. 李鳴,張思維,馬建輝,陳萬青,那彥群. 中華泌尿外科雜志. 2009 (06)
[4]前列腺癌的流行病學特征及晚期一線內(nèi)分泌治療分析[J]. 馬春光,葉定偉,李長嶺,周芳堅,姚旭東,張世林,戴波,張海梁,朱耀,沈益君. 中華外科雜志. 2008 (12)
本文編號：3327666
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