目 的1.人體前列腺癌和前列腺增生組織中Engrailed-2基因mRNA的表達(dá)2.Engrailed-2蛋白單克隆抗體的制備與鑒定3.人體前列腺癌和前列腺增生組織中Engrailed-2蛋白的表達(dá)方 法分別收集臨床病理確診的前列腺癌組織標(biāo)本20例,前列腺增生組織標(biāo)本25例,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR）檢測(cè)人體前列腺癌和前列腺增生組織標(biāo)本中Engrailed-2基因mRNA的表達(dá)。將Homeobox Engrailed-2基因（NM₀01427.3）C末端114aa序列連接到基因表達(dá)載體pET-28a,轉(zhuǎn)染大腸桿菌,表達(dá)純化EN2重組蛋白。用該EN2重組蛋白免疫小鼠,使用雜交瘤技術(shù)篩選表達(dá)EN2單克隆抗體的細(xì)胞株,使用ELISA、Western Blotting、免疫組化等方法鑒定抗體性質(zhì),將陽(yáng)性細(xì)胞株接種到小鼠腹腔進(jìn)行EN2單克隆抗體的大量制備。隨后,使用EN2單克隆抗體對(duì)人體前列腺癌和前列腺增生組織進(jìn)行免疫組化,分析EN2蛋白在人體前列腺癌組織和前列腺增生組織中的表達(dá)差異。結(jié) 果20例人體前列腺... 

【文章來(lái)源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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圖３．?３．?２?９６孔酶標(biāo)板測(cè)定抗體效價(jià)示意圖??Ｂ、Ｃ、Ｄ三行用于血清效價(jià)測(cè)定

?３方法???（４）電泳：以８０Ｖ的電壓進(jìn)行濃縮膠電泳，待蛋白樣品電泳至濃縮膠分離??膠交界處，調(diào)整電泳條件為１２０Ｖ，繼續(xù)電泳至蛋白樣品距ＳＤＳ－ＰＡＧＥ膠下方１??厘米左右，停止電泳；??（５）半干式電轉(zhuǎn)：將濾紙剪裁為５ｃｍｘ８ｃｍ大小，疊加在一起（１２張一沓），??放入電轉(zhuǎn)液中浸潤(rùn)，電轉(zhuǎn)槽底部涂抹上少量電轉(zhuǎn)液，潤(rùn)濕即可，按照?qǐng)D３．５．３所??示順序分別放置厚濾紙，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白膠和ＮＣ膜，注意正負(fù)極方向且正負(fù)極??的厚濾紙不能直接接觸，保證電流經(jīng)正極—厚濾紙￣？ＮＣ膜—ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白膠??—厚濾紙—負(fù)極穿過(guò)整個(gè)系統(tǒng)。定流２５ｍＡ，室溫電轉(zhuǎn)２小時(shí)；??（６）封閉：配置５０ｍｌ的５％脫脂奶粉，將整片ＮＣ膜浸沒(méi)入脫脂奶粉封閉??液中，４°Ｃ過(guò)夜孵育；??（７）加一抗：將純化好的ＥＮ２單抗稀釋為統(tǒng)一的１００以／ｍＬ，在５ｍＬＥＰ管??中各配置３?ｍＬ—抗，在ＮＣ膜下方編號(hào)，將各個(gè)泳道剪裁開，分別放入不同的??一抗中，室溫?fù)u床孵育１小時(shí)；??（８）加二抗：棄去ＥＰ管中的一抗，加入０．１％的：ＰＢＳＴ室溫?fù)u床５ｍｉｎ，洗??５遍，配置１：１００００山羊抗小鼠ＩｇＧ抗體－ＨＲＰ二抗，ＮＣ膜條帶放入其中，室??溫?fù)u床孵育１小時(shí)；??（９）顯色：將ＮＣ膜條帶取出，使用０．１％的ＰＢＳＴ室溫?fù)u床５ｍｉｎ，洗１０??遍。按照顯色液Ａ液：Ｂ液＝１：１配置，滴加到ＮＣ膜條帶上，室溫５－１０ｍｉｎ后，??濾紙吸干顯色液，保鮮膜上下均勻覆蓋；??（１０）暗室曝光顯影。??示意圖３．?５．?３?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ半干式電轉(zhuǎn)示意圖??３．５．４?ＥＮ２單克隆抗體與前列腺癌細(xì)胞系ＰＣ３、ＤＵ１４５、ＬＮＣａｐ細(xì)胞總蛋

５?倍，最大為?３１．４２?倍，且可以看出，組織?１?（３０．８６）、３?（２３．４２）、６?（３１．４２）、??２０?（２３．８８）的ＥＮ２基因表達(dá)更高。??２０例前列腺癌組織標(biāo)本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??４０－??３０－?ｉｊｆａ?置??Ｉ?Ｉ?ｊ?Ａ??〇?２〇－?｜??〇．ｊ－Ｔ－Ｔ－Ｔ－ｇＬＴ?ｇｆＴｉｑｌ?ＴＪ?ｐ｜Ｄｌ－Ｔ－〇ｊ－Ｔ－??ＢＰＨ?１?２?３?４?５?６?７?８?９?１０?１１?１２?１３?１４?１５?１６?１７?１８?１９?２０??前列腺癌組織標(biāo)本??圖４．?１?２０例前列腺癌和２５例前列腺增生組織標(biāo)本的ｑＲＴ－ＰＣＲ??采用２￣Ａ?ＡＣｔ法進(jìn)行計(jì)算，該數(shù)值大于１即表明該前列腺癌組織中ＥＮ２基因的表達(dá)高于??前列腺增生組。??４．２?Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ－２重組蛋白的原核表達(dá)??選取?ＥｎｇｒａｉｌｅｄＨｏｍｅｏｂｏｘ２?基因（ＮＭ＿００１４２７．３）的?Ｃ?末端?１１４ａａ?序列，將??２３??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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