發(fā)布時間：2021-07-30 08:59

　　背景:肝細(xì)胞肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤,是我國第四常見的惡性腫瘤,也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第三大原因,嚴(yán)重威脅人民群眾生命健康。臨床上,晚期肝癌患者往往沒有很好的治療辦法。肝癌對放化療的治療效果都理想,這使得靶向治療成為晚期肝癌治療中尚可以嘗試的治療手段。近年來,肝癌的靶向藥物治療方法開發(fā)取得了不少進(jìn)展。但靶向藥物治療過程中,耐藥問題的發(fā)生卻成為一個新的難題。在過去十多年中,索拉非尼是唯一批準(zhǔn)應(yīng)用于晚期肝癌治療的靶向藥物,它能顯著延長患者生存時間,延緩腫瘤進(jìn)展。但同時,索拉非尼應(yīng)用過程中,藥物耐藥產(chǎn)生的幾率也非常高,極大地限制了其臨床應(yīng)用效果。關(guān)于索拉非尼耐藥發(fā)生的機(jī)制的既往研究有很多報道。但其發(fā)生的具體機(jī)制尚不十分明確。micro RNAs通過調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄后表達(dá),參與了許多生物過程的調(diào)控。而在索拉非尼耐藥的發(fā)生發(fā)展過程中,是否有micro RNAs的參與,需要進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)方法:首先,我們建立了索拉非尼耐藥的肝癌細(xì)胞系,作為研究的體外模型。采用micro RNA測序,q PCR驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)手段,分析索拉非尼耐藥過程中,存在差異表達(dá)的micro RNAs。其次,采用CCK-8篩選其中... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

成功建立索拉非尼耐藥的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株。使用CCK-8試劑檢測細(xì)胞生長情況。在96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用第一天的細(xì)胞數(shù)量作為參照,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在相同濃度的索拉非尼處理情況下,隨著時間變化,相比于野生型細(xì)胞,耐藥細(xì)胞有更高的細(xì)胞活性。在96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用不加索拉非尼處理的細(xì)胞數(shù)量作為參照,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在不同濃度的索拉非尼處理情況下,觀察48小時時,細(xì)胞的生長情況。相比于野生型細(xì)胞,耐藥細(xì)胞的IC50更高。

已知miRNAs可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的各項(xiàng)進(jìn)程,并在其中扮演重要的角色,發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用。同時近期研究也發(fā)現(xiàn),miRNAs具有開發(fā)腫瘤治療藥物的潛力,或能用于增強(qiáng)其他腫瘤治療藥物的療效2624。因此,為了探究在索拉非尼耐藥過程中,miRNAs的變化情況,我們選用Huh7-SR細(xì)胞及其野生型Huh7細(xì)胞進(jìn)行miRNA測序,以確定可能影響索拉非尼耐藥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的miRNAs。miRNA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種細(xì)胞中存在26個顯著差異表達(dá)的miRNAs(圖2)。測序結(jié)果提示Huh7-SR細(xì)胞中,miR-671-3p、miR-378a-5 p、miR-328-3p、miR-486-3p和miR-378a-3p五個miRNAs較其野生型細(xì)胞顯著減少(圖2)。為了驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性,我們采用qRT-PCR方法在Huh7-SR,SK-Hep-1-SR和HepG2-SR三個細(xì)胞系中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-328-3p在Huh7-SR細(xì)胞中的表達(dá)量與測序結(jié)果不符,其余在三個耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況與測序數(shù)據(jù)相符(圖3A)。

為了進(jìn)一步檢測這些miRNAs的生物學(xué)功能,我們用miRNA寡核苷酸類似物(miRNA mimics)轉(zhuǎn)染進(jìn)行生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)。在三個耐藥肝癌細(xì)胞株中,分別轉(zhuǎn)染這五種miRNA mimics,用CCK-8檢測細(xì)胞數(shù)量,研究增加這些miRNAs的表達(dá)水平是否會影響細(xì)胞對索拉非尼的反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在三個耐藥細(xì)胞系中,增加miR-486-3p的表達(dá)能顯著增加耐藥細(xì)胞對索拉非尼敏感性(圖3B)。為了能從臨床水平進(jìn)一步檢驗(yàn)miR-486-3p在肝癌中的作用,我們采用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫Kaplan Meier-Plotter進(jìn)行分析27。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝癌數(shù)據(jù)庫中,患者腫瘤組織中miR-486-3p的水平越高,患者預(yù)后越好。miR-486-3p高的組的患者總體生存率(HR=0.38;95%CI:0.24到0.62;P=3.7×10-5)和無病生存率(HR=0.55;95%CI:0.36到0.83;P=0.0037)都顯著比miR-486-3p低的組好(圖4)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3311116