miR-486-3p通過抑制FGFR4和EGFR水平介導肝細胞肝癌索拉非尼耐藥的發(fā)生
發(fā)布時間：2021-07-30 08:59
背景:肝細胞肝癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤,是我國第四常見的惡性腫瘤,也是導致癌癥相關死亡的第三大原因,嚴重威脅人民群眾生命健康。臨床上,晚期肝癌患者往往沒有很好的治療辦法。肝癌對放化療的治療效果都理想,這使得靶向治療成為晚期肝癌治療中尚可以嘗試的治療手段。近年來,肝癌的靶向藥物治療方法開發(fā)取得了不少進展。但靶向藥物治療過程中,耐藥問題的發(fā)生卻成為一個新的難題。在過去十多年中,索拉非尼是唯一批準應用于晚期肝癌治療的靶向藥物,它能顯著延長患者生存時間,延緩腫瘤進展。但同時,索拉非尼應用過程中,藥物耐藥產(chǎn)生的幾率也非常高,極大地限制了其臨床應用效果。關于索拉非尼耐藥發(fā)生的機制的既往研究有很多報道。但其發(fā)生的具體機制尚不十分明確。micro RNAs通過調節(jié)蛋白轉錄后表達,參與了許多生物過程的調控。而在索拉非尼耐藥的發(fā)生發(fā)展過程中,是否有micro RNAs的參與,需要進一步研究。實驗方法:首先,我們建立了索拉非尼耐藥的肝癌細胞系,作為研究的體外模型。采用micro RNA測序,q PCR驗證等實驗手段,分析索拉非尼耐藥過程中,存在差異表達的micro RNAs。其次,采用CCK-8篩選其中...
【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：122 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
成功建立索拉非尼耐藥的肝細胞肝癌細胞株。使用CCK-8試劑檢測細胞生長情況。在96孔板中進行實驗,采用第一天的細胞數(shù)量作為參照,進行標準化。在相同濃度的索拉非尼處理情況下,隨著時間變化,相比于野生型細胞,耐藥細胞有更高的細胞活性。在96孔板中進行實驗,采用不加索拉非尼處理的細胞數(shù)量作為參照,進行標準化。在不同濃度的索拉非尼處理情況下,觀察48小時時,細胞的生長情況。相比于野生型細胞,耐藥細胞的IC50更高。
已知miRNAs可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的各項進程,并在其中扮演重要的角色,發(fā)揮轉錄后調節(jié)的作用。同時近期研究也發(fā)現(xiàn),miRNAs具有開發(fā)腫瘤治療藥物的潛力,或能用于增強其他腫瘤治療藥物的療效2624。因此,為了探究在索拉非尼耐藥過程中,miRNAs的變化情況,我們選用Huh7-SR細胞及其野生型Huh7細胞進行miRNA測序,以確定可能影響索拉非尼耐藥發(fā)生發(fā)展進程的miRNAs。miRNA測序結果發(fā)現(xiàn),兩種細胞中存在26個顯著差異表達的miRNAs(圖2)。測序結果提示Huh7-SR細胞中,miR-671-3p、miR-378a-5 p、miR-328-3p、miR-486-3p和miR-378a-3p五個miRNAs較其野生型細胞顯著減少(圖2)。為了驗證測序結果的可靠性,我們采用qRT-PCR方法在Huh7-SR,SK-Hep-1-SR和HepG2-SR三個細胞系中進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)miR-328-3p在Huh7-SR細胞中的表達量與測序結果不符,其余在三個耐藥細胞中的表達情況與測序數(shù)據(jù)相符(圖3A)。
為了進一步檢測這些miRNAs的生物學功能,我們用miRNA寡核苷酸類似物(miRNA mimics)轉染進行生物學功能實驗。在三個耐藥肝癌細胞株中,分別轉染這五種miRNA mimics,用CCK-8檢測細胞數(shù)量,研究增加這些miRNAs的表達水平是否會影響細胞對索拉非尼的反應。結果發(fā)現(xiàn),在三個耐藥細胞系中,增加miR-486-3p的表達能顯著增加耐藥細胞對索拉非尼敏感性(圖3B)。為了能從臨床水平進一步檢驗miR-486-3p在肝癌中的作用,我們采用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫Kaplan Meier-Plotter進行分析27。結果發(fā)現(xiàn)在肝癌數(shù)據(jù)庫中,患者腫瘤組織中miR-486-3p的水平越高,患者預后越好。miR-486-3p高的組的患者總體生存率(HR=0.38;95%CI:0.24到0.62;P=3.7×10-5)和無病生存率(HR=0.55;95%CI:0.36到0.83;P=0.0037)都顯著比miR-486-3p低的組好(圖4)。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function[J]. Jian Zhang,Sha Li,Lu Li,Meng Li,Chongye Guo,Jun Yao,Shuangli Mi. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2015(01)
[2]EGF mRNA和EGFR mRNA在肝細胞癌組織中的表達及其意義[J]. 趙蔭農(nóng),曹驥,吳飛翔,歐超,袁衛(wèi)平,莫欽國,韋薇,李瑗,蘇建家,梁安民. 癌癥. 2004(07)
本文編號：3311116
【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：122 頁
【學位級別】：博士
【部分圖文】：
成功建立索拉非尼耐藥的肝細胞肝癌細胞株。使用CCK-8試劑檢測細胞生長情況。在96孔板中進行實驗,采用第一天的細胞數(shù)量作為參照,進行標準化。在相同濃度的索拉非尼處理情況下,隨著時間變化,相比于野生型細胞,耐藥細胞有更高的細胞活性。在96孔板中進行實驗,采用不加索拉非尼處理的細胞數(shù)量作為參照,進行標準化。在不同濃度的索拉非尼處理情況下,觀察48小時時,細胞的生長情況。相比于野生型細胞,耐藥細胞的IC50更高。
已知miRNAs可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的各項進程,并在其中扮演重要的角色,發(fā)揮轉錄后調節(jié)的作用。同時近期研究也發(fā)現(xiàn),miRNAs具有開發(fā)腫瘤治療藥物的潛力,或能用于增強其他腫瘤治療藥物的療效2624。因此,為了探究在索拉非尼耐藥過程中,miRNAs的變化情況,我們選用Huh7-SR細胞及其野生型Huh7細胞進行miRNA測序,以確定可能影響索拉非尼耐藥發(fā)生發(fā)展進程的miRNAs。miRNA測序結果發(fā)現(xiàn),兩種細胞中存在26個顯著差異表達的miRNAs(圖2)。測序結果提示Huh7-SR細胞中,miR-671-3p、miR-378a-5 p、miR-328-3p、miR-486-3p和miR-378a-3p五個miRNAs較其野生型細胞顯著減少(圖2)。為了驗證測序結果的可靠性,我們采用qRT-PCR方法在Huh7-SR,SK-Hep-1-SR和HepG2-SR三個細胞系中進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)miR-328-3p在Huh7-SR細胞中的表達量與測序結果不符,其余在三個耐藥細胞中的表達情況與測序數(shù)據(jù)相符(圖3A)。
為了進一步檢測這些miRNAs的生物學功能,我們用miRNA寡核苷酸類似物(miRNA mimics)轉染進行生物學功能實驗。在三個耐藥肝癌細胞株中,分別轉染這五種miRNA mimics,用CCK-8檢測細胞數(shù)量,研究增加這些miRNAs的表達水平是否會影響細胞對索拉非尼的反應。結果發(fā)現(xiàn),在三個耐藥細胞系中,增加miR-486-3p的表達能顯著增加耐藥細胞對索拉非尼敏感性(圖3B)。為了能從臨床水平進一步檢驗miR-486-3p在肝癌中的作用,我們采用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫Kaplan Meier-Plotter進行分析27。結果發(fā)現(xiàn)在肝癌數(shù)據(jù)庫中,患者腫瘤組織中miR-486-3p的水平越高,患者預后越好。miR-486-3p高的組的患者總體生存率(HR=0.38;95%CI:0.24到0.62;P=3.7×10-5)和無病生存率(HR=0.55;95%CI:0.36到0.83;P=0.0037)都顯著比miR-486-3p低的組好(圖4)。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]Exosome and Exosomal MicroRNA: Trafficking, Sorting, and Function[J]. Jian Zhang,Sha Li,Lu Li,Meng Li,Chongye Guo,Jun Yao,Shuangli Mi. Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2015(01)
[2]EGF mRNA和EGFR mRNA在肝細胞癌組織中的表達及其意義[J]. 趙蔭農(nóng),曹驥,吳飛翔,歐超,袁衛(wèi)平,莫欽國,韋薇,李瑗,蘇建家,梁安民. 癌癥. 2004(07)
本文編號：3311116
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