目的 從人臍血中分化誘導(dǎo)出具有高度活性的NK細(xì)胞。構(gòu)建體外篩選模型,篩選出g MYL6系列小肽中能增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的小肽。在活性肽介入后,探究NK細(xì)胞對K562細(xì)胞增殖和凋亡方面的影響,并確定其抑制腫瘤細(xì)胞的作用方式,最終闡述其抑癌機(jī)制。方法1用Ficoll法從臍血中分離出單核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化出NK細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證NK細(xì)胞的成熟與活性,以保證獲得80%以上的成熟NK細(xì)胞。2以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞構(gòu)建體外篩選模型,小肽濃度設(shè)置25μM、50μM、100μM三個(gè)濃度梯度進(jìn)行篩選,用CCK-8方法篩選出能增強(qiáng)NK細(xì)胞毒作用的小肽,確定一種作用最強(qiáng)的小肽進(jìn)行下一步研究。3探究NK細(xì)胞對靶細(xì)胞增殖和凋亡的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞周期阻滯。4采用AO/EB熒光染色觀察靶細(xì)胞凋亡,流式細(xì)胞術(shù)Annexin v/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。5通過蛋白質(zhì)印記實(shí)驗(yàn)探究小肽提高NK細(xì)胞殺傷活性的途徑,并通過實(shí)時(shí)熒光核酸定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證,初步確定其抑癌機(jī)制。結(jié)果1從臍血中誘導(dǎo)分化出成熟具有活性的NK細(xì)胞。2經(jīng)過篩選25μM小肽D增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性最為顯著,其他濃度的各個(gè)小肽也有不同程度的作用。3小... 

【文章來源】：華北理工大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

NK細(xì)胞的生長歷程（200×）

華北理工大學(xué)碩士學(xué)位論文-161.2.2.2人臍血來源的NK細(xì)胞成熟及活性鑒定CD3分子為T細(xì)胞特有，CD56陽性CD3陰性表示為成熟的NK細(xì)胞（圖2B）。此外，還對誘導(dǎo)成功的NK細(xì)胞進(jìn)行活性鑒定，測其活化性受體NKp30、NKG2D的表達(dá)（圖2C、D）。如圖所示，誘導(dǎo)成熟的NK細(xì)胞為85.67%。NKp30在NK細(xì)胞中表達(dá)為97%，NKG2D在NK細(xì)胞中的表達(dá)為91%，表明誘導(dǎo)出來的NK細(xì)胞具有高度活性。圖2NK細(xì)胞的成熟及活性檢測（A：收集的細(xì)胞的散點(diǎn)圖；B：成熟的NK細(xì)胞中CD3-和CD56+的表達(dá)；C：NK細(xì)胞中表達(dá)的NKp30的百分比為97.6％；D：NKG2D的百分比為91％。）

第1章實(shí)驗(yàn)研究-171.2.3小肽的作用結(jié)果1.2.3.1gMYL6功能片段的篩選1）加入小肽8hNK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性在得到高度活性的NK細(xì)胞后，選定K562細(xì)胞為靶細(xì)胞構(gòu)建體外篩選模型。以2:1為效靶比，四種小肽分別設(shè)置25μM、50μM、100μM三個(gè)濃度梯度，確定8h和16h兩個(gè)時(shí)間段，采用CCK-8的方法進(jìn)行篩眩在活性肽的作用下，將四種小肽分別命名為A、B、C、D，“—”表示沒有提高。結(jié)果顯示活性肽D在25μM時(shí)提高NK細(xì)胞的殺傷率最大為（10.62±1.73）%；各組小肽在不同濃度時(shí)提高NK細(xì)胞的殺傷率見表11。NK細(xì)胞與K562細(xì)胞共孵育8h的殺傷率見圖3。表11小肽作用8h后提高NK細(xì)胞的殺傷率組別提高殺傷率(%)25μM50μM100μMA肽B肽C肽D肽1.25±0.89—8.22±1.0210.62±1.731.78±0.660.72±0.215.75±0.545.98±0.320.64±0.11——3.06±0.42圖3小肽作用8h后NK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷率注：*：P<0.05，**：P<0.012）加入小肽16hNK細(xì)胞對K562細(xì)胞的殺傷活性

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3286219