目的 從人臍血中分化誘導出具有高度活性的NK細胞。構建體外篩選模型,篩選出g MYL6系列小肽中能增強NK細胞活性的小肽。在活性肽介入后,探究NK細胞對K562細胞增殖和凋亡方面的影響,并確定其抑制腫瘤細胞的作用方式,最終闡述其抑癌機制。方法1用Ficoll法從臍血中分離出單核細胞進行誘導分化出NK細胞,采用流式細胞術驗證NK細胞的成熟與活性,以保證獲得80%以上的成熟NK細胞。2以K562細胞為靶細胞構建體外篩選模型,小肽濃度設置25μM、50μM、100μM三個濃度梯度進行篩選,用CCK-8方法篩選出能增強NK細胞毒作用的小肽,確定一種作用最強的小肽進行下一步研究。3探究NK細胞對靶細胞增殖和凋亡的影響,采用流式細胞術評估細胞周期阻滯。4采用AO/EB熒光染色觀察靶細胞凋亡,流式細胞術Annexin v/PI雙染法檢測細胞凋亡。5通過蛋白質印記實驗探究小肽提高NK細胞殺傷活性的途徑,并通過實時熒光核酸定量PCR進行驗證,初步確定其抑癌機制。結果1從臍血中誘導分化出成熟具有活性的NK細胞。2經過篩選25μM小肽D增強NK細胞殺傷活性最為顯著,其他濃度的各個小肽也有不同程度的作用。3小... 

【文章來源】：華北理工大學河北省

【文章頁數】：59 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

NK細胞的生長歷程（200×）

華北理工大學碩士學位論文-161.2.2.2人臍血來源的NK細胞成熟及活性鑒定CD3分子為T細胞特有，CD56陽性CD3陰性表示為成熟的NK細胞（圖2B）。此外，還對誘導成功的NK細胞進行活性鑒定，測其活化性受體NKp30、NKG2D的表達（圖2C、D）。如圖所示，誘導成熟的NK細胞為85.67%。NKp30在NK細胞中表達為97%，NKG2D在NK細胞中的表達為91%，表明誘導出來的NK細胞具有高度活性。圖2NK細胞的成熟及活性檢測（A：收集的細胞的散點圖；B：成熟的NK細胞中CD3-和CD56+的表達；C：NK細胞中表達的NKp30的百分比為97.6％；D：NKG2D的百分比為91％。）

第1章實驗研究-171.2.3小肽的作用結果1.2.3.1gMYL6功能片段的篩選1）加入小肽8hNK細胞對K562細胞的殺傷活性在得到高度活性的NK細胞后，選定K562細胞為靶細胞構建體外篩選模型。以2:1為效靶比，四種小肽分別設置25μM、50μM、100μM三個濃度梯度，確定8h和16h兩個時間段，采用CCK-8的方法進行篩眩在活性肽的作用下，將四種小肽分別命名為A、B、C、D，“—”表示沒有提高。結果顯示活性肽D在25μM時提高NK細胞的殺傷率最大為（10.62±1.73）%；各組小肽在不同濃度時提高NK細胞的殺傷率見表11。NK細胞與K562細胞共孵育8h的殺傷率見圖3。表11小肽作用8h后提高NK細胞的殺傷率組別提高殺傷率(%)25μM50μM100μMA肽B肽C肽D肽1.25±0.89—8.22±1.0210.62±1.731.78±0.660.72±0.215.75±0.545.98±0.320.64±0.11——3.06±0.42圖3小肽作用8h后NK細胞對K562細胞的殺傷率注：*：P<0.05，**：P<0.012）加入小肽16hNK細胞對K562細胞的殺傷活性

【參考文獻】：
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博士論文
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本文編號：3286219