目的觀察轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ在人永生化正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異性,探討其與肝癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的相關(guān)性。方法培養(yǎng)人永生化正常肝細(xì)胞系HHL5、HL7702和肝癌SMMC7721、Bel7402、HepG2、Hep3B細(xì)胞系;Hep3B細(xì)胞用衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型;倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài);MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率;Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞凋亡;RT-PCR和Western blotting技術(shù)分別檢測mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 C/EBPβ的mRNA和蛋白亞型C/EBPβ-1在4種人肝癌細(xì)胞系和永生化正常肝細(xì)胞系中均有表達(dá),但C/EBPβ-3僅在人永生化正常肝細(xì)胞系中表達(dá),在肝癌細(xì)胞系中不表達(dá);衣霉素能夠上調(diào)人肝癌Hep3B細(xì)胞C/EBPβ的mRNA和蛋白表達(dá)水平,明顯上調(diào)C/EBPβ-3的表達(dá)水平;衣霉素能夠誘導(dǎo)人肝癌Hep3B細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡,表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡和類凋亡兩種方式。結(jié)論 C/EBPβ的蛋白亞型C/EBPβ-3在人永生化正常肝細(xì)胞中表達(dá)而在肝癌細(xì)胞中不表達(dá);C/EBPβ參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的人肝癌細(xì)... 

【文章來源】：西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版). 2017,38(04)北大核心CSCD

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圖１Ｃ／ＥＢＰβ在人永生化正常肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況Ｆｉｇ．１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｎｏｒｍａｌ

ｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ２．２衣霉素對人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞中Ｃ／ＥＢＰβ表達(dá)的影響ＲＴ－ＰＣＲ結(jié)果顯示，衣霉素（公認(rèn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑［５］）可濃度依賴性上調(diào)人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄（圖２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ－ｔｉｎｇ結(jié)果顯示，衣霉素能夠同時上調(diào)Ｃ／ＥＢＰβ３種蛋白亞型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表達(dá)，其中以Ｃ／ＥＢＰβ－３上調(diào)更為明顯（圖２Ｂ）。圖２衣霉素上調(diào)人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞的Ｃ／ＥＢＰβ表達(dá)Ｆｉｇ．２ＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＨｅｐ３ＢｃｅｌｌｓＡ：衣霉素濃度依賴性上調(diào)人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲ－ＮＡ表達(dá)水平；Ｂ：衣霉素濃度依賴性上調(diào)人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞中Ｃ／ＥＢＰβ３種蛋白亞型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表達(dá)水平。ＴＭ：衣霉素。２．３衣霉素對人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞死亡的影響ＭＴＴ法結(jié)果顯示，衣霉素能夠濃度依賴性抑制人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞的生長（圖３Ａ）。用衣霉素處理人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞后，通過Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色，發(fā)現(xiàn)衣霉素處理組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮和核碎裂（圖３Ｂ）。此外，在倒置光鏡顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)空泡形成（細(xì)胞發(fā)生類凋亡后的特征性表現(xiàn)［６］）（圖３Ｃ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ結(jié)果顯示，衣霉素能夠濃度依賴性上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特

４期盧新蘭，盧桂芳，王新，等．Ｃ／ＥＢＰβ在人正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)及其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞死亡的關(guān)系ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ震蕩１０ｍｉｎ，將酶標(biāo)儀的吸收波長設(shè)定為４９０ｎｍ，然后將９６孔板置入酶聯(lián)免疫檢測儀（酶標(biāo)儀）中，測定各孔的相對吸光度值（Ａ值）。細(xì)胞抑制率（％）＝（１－實驗組Ａ值／對照組Ａ值）×１００％。１．２．３Ｈｏｅｃｈｓｔ染色測定細(xì)胞凋亡將１０ｍｍ×１０ｍｍ的蓋玻片放入６孔板中，取對數(shù)生長期人肝細(xì)胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞常規(guī)消化、離心后，以５×１０５個／孔將細(xì)胞懸液接種于６孔板中，將其輕輕移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。２４ｈ后，棄上清，未加衣霉素干預(yù)者為對照組，實驗組用衣霉素工作液１０μｇ／ｍＬ處理細(xì)胞。２４ｈ后吸掉舊培養(yǎng)基，加入５００μＬ固定液，室溫下固定１５ｍｉｎ后，ＰＢＳ洗滌。加入５００μＬ的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色液，室溫下避光染色５ｍｉｎ。ＰＢＳ洗滌后滴１滴９５０ｍＬ／Ｌ甘油于載玻片上，用蓋玻片蓋上，使蓋玻片貼有細(xì)胞的面接觸封片液。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的顏色及形態(tài)改變并拍照。１．２．４ＲＴ－ＰＣＲ法測定ｍＲＮＡ表達(dá)水平提取上述各細(xì)胞系或衣霉素處理后的各組Ｈｅｐ３Ｂ細(xì)胞中的總ＲＮＡ，參照ＧｅｎＢａｎｋ中Ｃ／ＥＢＰβ序列引物設(shè)計，序列如下，上游：５′－ＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧ－３′，下游：５′－ＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＧＴＡＧＴＡＧＡＡ－Ｇ－


本文編號：3275285