目的觀察轉錄因子C/EBPβ在人永生化正常肝細胞和肝癌細胞系中的表達差異性,探討其與肝癌細胞內質網(wǎng)應激介導的細胞死亡的相關性。方法培養(yǎng)人永生化正常肝細胞系HHL5、HL7702和肝癌SMMC7721、Bel7402、HepG2、Hep3B細胞系;Hep3B細胞用衣霉素誘導內質網(wǎng)應激細胞模型;倒置光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài);MTT法檢測細胞生長抑制率;Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下檢測細胞凋亡;RT-PCR和Western blotting技術分別檢測mRNA和蛋白的表達水平。結果 C/EBPβ的mRNA和蛋白亞型C/EBPβ-1在4種人肝癌細胞系和永生化正常肝細胞系中均有表達,但C/EBPβ-3僅在人永生化正常肝細胞系中表達,在肝癌細胞系中不表達;衣霉素能夠上調人肝癌Hep3B細胞C/EBPβ的mRNA和蛋白表達水平,明顯上調C/EBPβ-3的表達水平;衣霉素能夠誘導人肝癌Hep3B細胞內質網(wǎng)應激介導的細胞死亡,表現(xiàn)為細胞凋亡和類凋亡兩種方式。結論 C/EBPβ的蛋白亞型C/EBPβ-3在人永生化正常肝細胞中表達而在肝癌細胞中不表達;C/EBPβ參與內質網(wǎng)應激介導的人肝癌細... 

【文章來源】：西安交通大學學報(醫(yī)學版). 2017,38(04)北大核心CSCD

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圖１Ｃ／ＥＢＰβ在人永生化正常肝細胞系和肝癌細胞系中的表達情況Ｆｉｇ．１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄｎｏｒｍａｌ

ｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ２．２衣霉素對人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞中Ｃ／ＥＢＰβ表達的影響ＲＴ－ＰＣＲ結果顯示，衣霉素（公認內質網(wǎng)應激激活劑［５］）可濃度依賴性上調人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲＮＡ轉錄（圖２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ－ｔｉｎｇ結果顯示，衣霉素能夠同時上調Ｃ／ＥＢＰβ３種蛋白亞型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表達，其中以Ｃ／ＥＢＰβ－３上調更為明顯（圖２Ｂ）。圖２衣霉素上調人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞的Ｃ／ＥＢＰβ表達Ｆｉｇ．２ＴｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣ／ＥＢＰβｉｎｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａＨｅｐ３ＢｃｅｌｌｓＡ：衣霉素濃度依賴性上調人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞中Ｃ／ＥＢＰβ的ｍＲ－ＮＡ表達水平；Ｂ：衣霉素濃度依賴性上調人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞中Ｃ／ＥＢＰβ３種蛋白亞型Ｃ／ＥＢＰβ－１、２、３的表達水平。ＴＭ：衣霉素。２．３衣霉素對人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞死亡的影響ＭＴＴ法結果顯示，衣霉素能夠濃度依賴性抑制人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞的生長（圖３Ａ）。用衣霉素處理人肝癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞后，通過Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色，發(fā)現(xiàn)衣霉素處理組細胞出現(xiàn)細胞核皺縮和核碎裂（圖３Ｂ）。此外，在倒置光鏡顯微鏡下觀察到細胞內空泡形成（細胞發(fā)生類凋亡后的特征性表現(xiàn)［６］）（圖３Ｃ）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ結果顯示，衣霉素能夠濃度依賴性上調內質網(wǎng)應激特

４期盧新蘭，盧桂芳，王新，等．Ｃ／ＥＢＰβ在人正常肝細胞和肝癌細胞系中的差異表達及其與內質網(wǎng)應激相關細胞死亡的關系ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ震蕩１０ｍｉｎ，將酶標儀的吸收波長設定為４９０ｎｍ，然后將９６孔板置入酶聯(lián)免疫檢測儀（酶標儀）中，測定各孔的相對吸光度值（Ａ值）。細胞抑制率（％）＝（１－實驗組Ａ值／對照組Ａ值）×１００％。１．２．３Ｈｏｅｃｈｓｔ染色測定細胞凋亡將１０ｍｍ×１０ｍｍ的蓋玻片放入６孔板中，取對數(shù)生長期人肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ細胞常規(guī)消化、離心后，以５×１０５個／孔將細胞懸液接種于６孔板中，將其輕輕移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。２４ｈ后，棄上清，未加衣霉素干預者為對照組，實驗組用衣霉素工作液１０μｇ／ｍＬ處理細胞。２４ｈ后吸掉舊培養(yǎng)基，加入５００μＬ固定液，室溫下固定１５ｍｉｎ后，ＰＢＳ洗滌。加入５００μＬ的Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色液，室溫下避光染色５ｍｉｎ。ＰＢＳ洗滌后滴１滴９５０ｍＬ／Ｌ甘油于載玻片上，用蓋玻片蓋上，使蓋玻片貼有細胞的面接觸封片液。熒光顯微鏡下觀察細胞核的顏色及形態(tài)改變并拍照。１．２．４ＲＴ－ＰＣＲ法測定ｍＲＮＡ表達水平提取上述各細胞系或衣霉素處理后的各組Ｈｅｐ３Ｂ細胞中的總ＲＮＡ，參照ＧｅｎＢａｎｋ中Ｃ／ＥＢＰβ序列引物設計，序列如下，上游：５′－ＧＴＴＣＡＴＧＣＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＧ－３′，下游：５′－ＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＣＣＴＣＧＴＡＧＴＡＧＡＡ－Ｇ－


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