發(fā)布時(shí)間：2021-07-04 00:53

　　背景:目前已經(jīng)報(bào)道了KCTD11在幾種腫瘤類型中是潛在的腫瘤抑制劑。然而,尚未在人類非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中報(bào)道KCTD11的表達(dá)及其作用。其潛在的分子機(jī)制是否與其具有Cullin介導(dǎo)的活性的KCTD11 BTB結(jié)構(gòu)域相關(guān)尚不清楚。研究方法:利用免疫組化檢測(cè)139例NSCLC患者組織樣本KCTD11的表達(dá)情況并分析其與諸多臨床病理因素的相關(guān)性。在體內(nèi)外驗(yàn)證KCTD11對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。采用Western blot、雙熒光素酶報(bào)告基因、RT-qpcr、免疫熒光和核漿蛋白質(zhì)分離觀測(cè)Wnt通路和Hippo通路的活性變化及對(duì)EMT過程的作用。免疫沉淀、共轉(zhuǎn)染和構(gòu)建剪切體KCTD11-ΔBTB驗(yàn)證KCTD11對(duì)Wnt/β-catenin與Hippo/YAP的潛在作用及KCTD11自身作用位點(diǎn)。結(jié)果:在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)KCTD11在肺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá),并且與分化程度,腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。KCTD11的低表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。KCTD11的過表達(dá)抑制了肺癌細(xì)胞的增殖和遷移,在敲除后結(jié)果相反。進(jìn)一步的研究表明,KCTD11通過抑制β-catenin和YA... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：46 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

KCTD11抑制NSCLC的增殖和侵襲A-C：在過表達(dá)KCTD11的A549細(xì)胞中，集落形成測(cè)定，Transwell測(cè)定和MTT測(cè)定顯示細(xì)胞的增殖和侵襲能力減小

14中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文補(bǔ)充圖S1KCTD11抑制NSCLC細(xì)胞的惡性行為A–C：在過表達(dá)KCTD11的H460細(xì)胞中，集落形成測(cè)定，Transwell測(cè)定和MTT測(cè)定顯示細(xì)胞的增殖和侵襲減少。D-F：而集落形成測(cè)定，Transwell測(cè)定和MTT測(cè)定表明，在缺失KCTD11的HBE細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖和侵襲增加。G：在裸鼠中過表達(dá)KCTD11并飼養(yǎng)6周后未進(jìn)行解剖的裸鼠的照片。H：與對(duì)照組（n=7）相比，向裸鼠（n=7）的尾靜脈注射穩(wěn)定表達(dá)KCTD11的A549細(xì)胞（G418篩查）減少了肺轉(zhuǎn)移的病灶數(shù)�？s寫：EV，空向量；NC，負(fù)控制。3.3KCTD11通過上調(diào)NSCLC細(xì)胞中YAP的磷酸化水平激活了Hippo通路通過雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定，轉(zhuǎn)染KCTD11上調(diào)了Hippo信號(hào)通路的活性，而敲除KCTD11抑制了Hippo信號(hào)通路的活性（圖3A-B）。然后，研究發(fā)現(xiàn)在KCTD11過表達(dá)的A549細(xì)胞中，與Hippo信號(hào)通路相關(guān)的靶基因CTGF，CYR61和cyclinEmRNA被下調(diào)，而在KCTD11敲除的H1299細(xì)胞中被上調(diào)（圖3C-D），表明KCTD11參與Hippo信號(hào)通路。因此，我們很好奇KCTD11在Hippo通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中是否參與調(diào)節(jié)YAP/P-YAP的表達(dá)。在過表達(dá)KCTD11的A549細(xì)胞和H460細(xì)胞系以及缺乏內(nèi)源性KCTD11的H1299和HBE細(xì)胞系中，YAP，LATS1均未見明顯變化，但研究發(fā)現(xiàn)P-YAP被KCTD11明顯上調(diào)。當(dāng)研究中敲除內(nèi)源性KCTD11時(shí)，我們觀察到在H1299細(xì)胞和HBE細(xì)胞中P-YAP被下調(diào)。與增殖相關(guān)的基因CyclinE和CTGF在KCTD11過表達(dá)的細(xì)胞系被下調(diào)，而在缺乏

15中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文內(nèi)源性KCTD11表達(dá)的細(xì)胞系被上調(diào)（圖3E-F）。通過細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)蛋白分離和免疫熒光，我們還發(fā)現(xiàn)YAP的核轉(zhuǎn)位在轉(zhuǎn)染KCTD11的A549細(xì)胞系中受到抑制。圖3G，I）。在H1299細(xì)胞系中結(jié)果相反，KCTD11的敲除促進(jìn)了YAP的核易位（圖3H，J）。因此，這些結(jié)果表明KCTD11通過促進(jìn)YAP的磷酸化激活了Hippo信號(hào)通路。圖3KCTD11通過上調(diào)NSCLC細(xì)胞中YAP的磷酸化水平來(lái)激活Hippo途徑A-B：KCTD11過表達(dá)抑制了TEAD的轉(zhuǎn)錄活性。HippopGTII熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定表明，KCTD11在A549細(xì)胞中的過表達(dá)上調(diào)了Hippo信號(hào)通路的活性，而缺失KCTD11在H1299細(xì)胞中則抑制了Hippo信號(hào)通路的活性。實(shí)驗(yàn)用對(duì)照或wnt3a條件培養(yǎng)基處理6小時(shí)。C-D：在過表達(dá)KCTD11的A549細(xì)胞中下調(diào)了Hippo通路的目標(biāo)靶基因CTGF，CYR61和CyclinEmRNA表達(dá)水平，在缺失KCTD11的H1299細(xì)胞中上調(diào)了其目標(biāo)靶基因的mRNA表達(dá)水平。E-F：Western印跡顯示，在過表達(dá)KCTD11的A549細(xì)胞和H460細(xì)胞中，YAP的磷酸化水平增加，并且Hippo途徑的靶基因CTGF和CyclinE的表達(dá)水平下調(diào)。在缺失KCTD11的H1299細(xì)胞和HBE細(xì)胞中，YAP的磷酸化水平降低，CTGF和CyclinE的表達(dá)水平上調(diào)，GAPDH用作上樣對(duì)照。使用ImageJ軟件分析灰度值。G–J：細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)蛋白分離和免疫熒光表明，在轉(zhuǎn)染KCTD11后，A549細(xì)胞系中YAP的核轉(zhuǎn)位受到抑制，并且


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