研究目的1.通過二代測序技術篩選三陰性乳腺癌細胞系中CENP-U差異表達相關基因和血管生成相關基因。2.通過體外實驗,在MDA-MB-231和CAL51中建立CENP-U穩(wěn)定表達細胞系,分析CENP-U基因在不同細胞系中的表達情況及對血管形成的作用。3.通過體內實驗,分析小鼠乳腺癌模型中CENP-U基因與血管生成因子的相關性及對血管形成的影響。研究方法1.運用二代測序技術分析基因功能;分析基因與疾病的關系;分析基因組、化學和系統(tǒng)功能信息;分析人類各項反應及生物學通路。測序分析:提取總RNA,然后m RNA富集,雙連c DNA合成,之后末端修復,加A和接頭,選出預測片段后,進行PCR擴增,并建立文庫,后二代測序儀測序。2.采用實時定量PCR方法檢測不同細胞系中CENP-U在m RNA水平表達情況,通過Western blotting檢測不同細胞系中的CENP-U在蛋白水平表達情況。3.通過轉染質粒,在MDA-MB-231和CAL51中構建穩(wěn)定表達CENP-U細胞穩(wěn)系,設置對照組（vector組）和降表達組（sh CENP-U組）。采用MTT比色法和平板克隆實驗檢測細胞穩(wěn)系中不同組間細胞的... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數】：143 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

基因測序流程圖

天津醫(yī)科大學博士學位論文 一、CENP-U 在三陰性乳腺癌細胞系的二代測序分析研見測序接頭注釋），AMPure XP beads 篩選大小為 200bp 左右的 cDNA，PCR 增，AMPure XP beads 再次純化 PCR 產物，最終獲得理想的文庫。其原理如圖 2 左所示。鏈特異性建庫：第一條鏈方法與 NEB 普通建庫方法相同，關鍵在于合成二條鏈時有不同之處：dNTPs 中的 dTTP 由 dUTP 取代，之后同樣進行 cDNA 端修復、加 A 尾、連接測序接頭和長度篩選，然后先使用 USER 酶降解含 U cDNA 第二鏈再進行 PCR 擴增并獲得文庫。鏈特異性文庫的優(yōu)點很多，例如相同條件下，可以獲取更多、更為有效的數據信息；能獲得更準確的基因定位定量與基因注釋信息等等。其原理如下圖 2 右所示。

.3 上機測序文庫檢驗合格后，把不同的文庫按有效濃度、目標下機數據量的需求 po上機行 Illumina HiSeq 測序。測序的基本原理：一邊合成，同時測equencing by Synthesis)。工作原理：在測序的 flow cell 中加入不同熒光dNTP、DNA 聚合酶和接頭引物，同時擴增，當每一個測序簇延伸至互被熒光標記的 dNTP 就能釋放出一對一的熒光信號，這些熒光信號可以準確捕獲，同步的計算機軟件會將光信號轉化為測序的峰值，最后得到的序列信息。.4 信息分析流程RNA-seq 的核心程序是基因表達差異的顯著性分析[23]，有多種比對方統(tǒng)計學方法，比較兩種或更多種條件下的基因表達差異，以鑒定與條件定基因，并進一步分析這些特定基因表達異常位點的生物學意義。分析許多方面：質量控制，定量，比對，差異顯著性分析和功能富集分析，錄本預測，變異位點，融合基因分析和可變剪接。如下圖 3 所示。


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