研究目的1.通過二代測序技術(shù)篩選三陰性乳腺癌細(xì)胞系中CENP-U差異表達(dá)相關(guān)基因和血管生成相關(guān)基因。2.通過體外實(shí)驗(yàn),在MDA-MB-231和CAL51中建立CENP-U穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,分析CENP-U基因在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況及對血管形成的作用。3.通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn),分析小鼠乳腺癌模型中CENP-U基因與血管生成因子的相關(guān)性及對血管形成的影響。研究方法1.運(yùn)用二代測序技術(shù)分析基因功能;分析基因與疾病的關(guān)系;分析基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息;分析人類各項(xiàng)反應(yīng)及生物學(xué)通路。測序分析:提取總RNA,然后m RNA富集,雙連c DNA合成,之后末端修復(fù),加A和接頭,選出預(yù)測片段后,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并建立文庫,后二代測序儀測序。2.采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測不同細(xì)胞系中CENP-U在m RNA水平表達(dá)情況,通過Western blotting檢測不同細(xì)胞系中的CENP-U在蛋白水平表達(dá)情況。3.通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,在MDA-MB-231和CAL51中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CENP-U細(xì)胞穩(wěn)系,設(shè)置對照組（vector組）和降表達(dá)組（sh CENP-U組）。采用MTT比色法和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞穩(wěn)系中不同組間細(xì)胞的... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：143 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

基因測序流程圖

天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 一、CENP-U 在三陰性乳腺癌細(xì)胞系的二代測序分析研見測序接頭注釋），AMPure XP beads 篩選大小為 200bp 左右的 cDNA，PCR 增，AMPure XP beads 再次純化 PCR 產(chǎn)物，最終獲得理想的文庫。其原理如圖 2 左所示。鏈特異性建庫：第一條鏈方法與 NEB 普通建庫方法相同，關(guān)鍵在于合成二條鏈時(shí)有不同之處：dNTPs 中的 dTTP 由 dUTP 取代，之后同樣進(jìn)行 cDNA 端修復(fù)、加 A 尾、連接測序接頭和長度篩選，然后先使用 USER 酶降解含 U cDNA 第二鏈再進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并獲得文庫。鏈特異性文庫的優(yōu)點(diǎn)很多，例如相同條件下，可以獲取更多、更為有效的數(shù)據(jù)信息；能獲得更準(zhǔn)確的基因定位定量與基因注釋信息等等。其原理如下圖 2 右所示。

.3 上機(jī)測序文庫檢驗(yàn)合格后，把不同的文庫按有效濃度、目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求 po上機(jī)行 Illumina HiSeq 測序。測序的基本原理：一邊合成，同時(shí)測equencing by Synthesis)。工作原理：在測序的 flow cell 中加入不同熒光dNTP、DNA 聚合酶和接頭引物，同時(shí)擴(kuò)增，當(dāng)每一個(gè)測序簇延伸至互被熒光標(biāo)記的 dNTP 就能釋放出一對一的熒光信號，這些熒光信號可以準(zhǔn)確捕獲，同步的計(jì)算機(jī)軟件會(huì)將光信號轉(zhuǎn)化為測序的峰值，最后得到的序列信息。.4 信息分析流程RNA-seq 的核心程序是基因表達(dá)差異的顯著性分析[23]，有多種比對方統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，比較兩種或更多種條件下的基因表達(dá)差異，以鑒定與條件定基因，并進(jìn)一步分析這些特定基因表達(dá)異常位點(diǎn)的生物學(xué)意義。分析許多方面：質(zhì)量控制，定量，比對，差異顯著性分析和功能富集分析，錄本預(yù)測，變異位點(diǎn)，融合基因分析和可變剪接。如下圖 3 所示。


本文編號：3255595