目的:探討miRNA-100在宮頸癌中的表達情況,以及改變其表達水平是否可以影響宮頸癌細胞的惡性生物學(xué)行為。方法:1.采用qRT-PCR檢測細胞系（宮頸癌細胞HeLa,SiHa和人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT）以及21例未經(jīng)治療的宮頸癌臨床病例標本（癌組織和鄰近正常組織）中的miRNA-100的表達情況。2.采用Western blotting檢測宮頸癌組織和鄰近正常組織中Shp2蛋白的含量。3.在宮頸癌細胞中感染慢病毒載體,建立敲低miRNA-100表達的Hela細胞株和抬高miRNA-100表達的SiHa細胞株。4.利用構(gòu)建好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株來研究miRNA-100的生物學(xué)功能。（1）流式細胞術(shù)檢測HeLa和SiHa細胞中Ki67蛋白的陽性率（Ki67蛋白的表達水平可反應(yīng)腫瘤細胞的惡性增殖能力）;（2）平板克隆實驗檢測HeLa和SiHa細胞的克隆形成能力;（3）Transwell實驗檢測HeLa和SiHa細胞的遷移和侵襲能力;5.利用Western blotting檢測Shp2蛋白表達水平的改變及下游信號通路中p-ERK和p-AKT的改變。結(jié)果:1.與人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT相比... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

qRT-PCR檢測miRNA-100在宮頸癌組織和細胞中的表達情況

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文29圖2Westernblotting檢測宮頸癌組織和細胞中Shp2的表達情況。A：Shp2在宮頸癌組織中表達上升；B：Shp2在宮頸癌細胞中表達上升。*P<0.05，***P<0.001。Fig2WesternblottingwasusedtodetecttheexpressionofShp2incervicalcancertissuesandcells.A:Shp2expressionincreasesincervicalcancertissues;B:Shp2expressionisincreasedincervicalcancercells.*P<0.05,***P<0.001.3.3敲低或過表達miRNA-100的宮頸癌細胞株的建立前期實驗中通過qRT-PCR檢測結(jié)果可知，HeLa細胞中的miRNA-100表達高于SiHa細胞株。因此，在HeLa細胞中轉(zhuǎn)染敲低miRNA-100的慢病毒載體，而在SiHa細胞株中轉(zhuǎn)染過表達miRNA-100的慢病毒載體。具體即是將hsa-miRNA-100-5pinhibitor及陰性對照感染HeLa細胞株，將hsa-miRNA-100-5pmimic及陰性對照感染SiHa細胞株，然后用嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達的細胞株，直至用倒置顯微鏡可以觀察到所有的細胞均能夠表達GFP熒光（如圖3A）。由于本實驗中的慢病毒無法直接通過qRT-PCR的方法檢測其轉(zhuǎn)染效率，因此我們采用Westernblotting檢測了miRNA-100的直接靶蛋白mTOR的表達水平，以驗證慢病毒的轉(zhuǎn)染結(jié)果。通過Westernblotting的檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA-100-5pinhibitor的HeLa細胞株，mTOR蛋白的表達水平高于未處理組和陰性對照組（如圖3B）；

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文30而轉(zhuǎn)染了miRNA-100-5pmimic的SiHa細胞株，mTOR蛋白的表達水平低于未處理組和陰性對照組（如圖3B）。上述結(jié)果表明，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式，我們構(gòu)建了穩(wěn)定敲低miRNA-100-5p表達的HeLa細胞株和穩(wěn)定過表達miRNA-100-5p的SiHa細胞株。圖3A：HeLa和SiHa細胞穩(wěn)定表達GFP熒光蛋白。B：Westernblotting檢測miRNA-100直接靶蛋白mTOR的表達情況：在HeLa細胞中下調(diào)miRNA-100表達后，mTOR表達水平上升；在SiHa細胞中過表達miRNA-100后，mTOR表達水平下降。Figure3A:HeLaandSiHacellsstablyexpressGFPfluorescentprotein.B:WesternblottingwasusedtodetecttheexpressionofmTOR-100:afterdown-regulatingmiRNA-100expressioninHeLacells,mTORexpressionlevelsincreased;aftermiRNA-100overexpressioninSiHacells,mTORexpressionlevelsdecreased.3.4miRNA-100對宮頸癌細胞增殖能力的影響Ki67蛋白的表達水平可反應(yīng)腫瘤細胞的惡性增殖能力，其陽性率越高代表腫瘤的增殖能力越強。取對數(shù)生長期的HeLa細胞分為三組，即未處理組（Control）、陰性對照組（miRNA-100NC）和抑制組（inhibitor）；同樣，SiHa細胞也分為三

【參考文獻】：
期刊論文
[1]免疫調(diào)節(jié)細胞FoxP3+Treg及免疫蛋白PD-L1在宮頸病變微環(huán)境中的表達[J]. 馬茜,趙敏伊,魏星,趙娟,楊婷,張倩,王凱,楊筱鳳.  中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報. 2017(01)
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