一碳代謝通路中多種代謝酶與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展都有密切關系,它們都可以作為腫瘤治療的潛在靶點.絲氨酸羥甲基轉移酶2（SHMT2）作為其中的關鍵代謝酶之一,對于腫瘤細胞的生長增殖具有非常重要的意義.然而SHMT2參與調(diào)解腫瘤細胞代謝的具體作用機制目前尚不明確.本研究發(fā)現(xiàn)SIRT5能去琥珀�；疭HMT2,提升其酶活,并鑒定到第181位賴氨酸是SHMT2的主要琥珀�；稽c.同時,本文還發(fā)現(xiàn)高濃度的甲氨蝶呤（MTX）能通過抑制SIRT5的表達,提升SHMT2琥珀�；�,達到抑制腫瘤細胞增殖的目的,這也為通過抑制SIRT5阻斷腫瘤生長提供了新的理論支撐. 

【文章來源】：復旦學報(自然科學版). 2020,59(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

SHMT2和SIRT5相互作用

由于SIRT5是去�；揎椕�，具備去琥珀酰化，去丙二酰化和去戊二�；钚�，且這些蛋白翻譯后修飾的過程是可逆的，煙酰胺（Nicotinamide,NAM）作為SIRT5去�；揎棶a(chǎn)物，能夠反饋抑制去�；揎椀陌l(fā)生，故使用NAM處理細胞，以確定SHMT2能夠被�；揎棧ㄟ^包裝慢病毒感染HEK293T細胞，我們構建了表達Flag-SHMT2的穩(wěn)定細胞系．用500μmol/L NAM處理該穩(wěn)定株后發(fā)現(xiàn)，在8h內(nèi)，隨著時間的增加，SHMT2琥珀酰化水平不斷提高，而丙二�；臀於；瘏s無明顯變化趨勢（圖2(a））．因此，確定SHMT2能夠被琥珀�；揎棧^而，我們將Flag-SHMT2和HA-SIRT5共轉于HEK293T細胞中，經(jīng)Western blot驗證，SIRT5能去琥珀�；疭HMT2蛋白（圖2(c））．同時，為了驗證SHMT2蛋白的琥珀�；瘜ζ涿富畹挠绊�，我們使用DL-β-苯基絲氨酸作為SHMT2酶活反應底物檢測其酶活，發(fā)現(xiàn)NAM處理會降低SHMT2酶活性，而SIRT5則能顯著提升其酶活性（圖2(b,d））．這證明了SHMT2的琥珀�；揎棔种票旧淼拇呋钚裕�

首先，為進一步確認SHMT2蛋白的主要琥珀�；稽c，我們將這些位點上的賴氨酸K分別突變?yōu)楣劝彼酔（模擬琥珀�；揎棧┖途彼酭（模擬去琥珀�；揎棧�，并檢測相應突變蛋白的琥珀�；揎椝胶兔富睿畬嶒灡砻鳎号c野生型SHMT2蛋白相比，K181E突變蛋白的琥珀�；郊懊富罹@著降低（圖3(b））．雖然K269E,K302E,K469E等3個位點的琥珀�；揎椌兴抡{(diào)，但其相應酶活卻顯著升高（圖3(b）），所以，綜上，我們初步確定K181位點是SHMT2蛋白的主要琥珀�；稽c．其次通過實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，SHMT2突變蛋白K181E及K181R的酶活在體外顯著性降低（圖3(c））．同時，在測定酶活的反應液中分別加入HA-SIRT5或NAM，我們發(fā)現(xiàn)野生型的SHMT2蛋白酶活會分別顯著性地提升及降低，而K181E和K181R兩個突變蛋白的酶活卻基本沒有發(fā)生改變（圖3(c）），表明SHMT2的181位點突變之后，其酶活不再受SIRT5和NAM影響，進一步證明第181位賴氨酸是SHMT2的主要琥珀�；揎椢稽c．值得注意的是，在加入SIRT5之后K181R酶活顯著降低（圖3(c）），這可能是SHMT2存在其他位點受SIRT5調(diào)控．K181E突變體酶活較低（～0.2），故過表達SIRT5之后酶活無進一步的明顯變化；而K181R酶活較高（～0.5），故對K181R的影響較大．

【參考文獻】：
期刊論文
[1]SIRT5, functions in cellular metabolism with a multiple enzymatic activities[J]. YANG Xin,LIU BoYa,ZHU WeiGuo,LUO JianYuan.  Science China（Life Sciences）. 2015(09)



本文編號：3232260