腫瘤微環(huán)境的靶向治療已取得突破性的研究進(jìn)展并被應(yīng)用于臨床,包括直接使用抗體靶向和封閉免疫學(xué)相關(guān)信號(hào)通路,或者將抗體與其它功能蛋白或片段融合表達(dá),進(jìn)行靶向治療。此外,細(xì)胞因子治療對(duì)腫瘤微環(huán)境中相關(guān)免疫細(xì)胞信號(hào)通路的激活發(fā)揮著重要的作用。本課題聚焦于免疫檢查點(diǎn)分子和細(xì)胞因子,設(shè)計(jì)并表達(dá)mPD1（mouse programmed death-1）分子胞外段和mIL-15（mouse interleukin-15）功能片段的融合蛋白。該融合蛋白將以mPD1區(qū)段為彈頭,通過靶向腫瘤細(xì)胞表面的mPD-L1（mouse programmed death ligand-1）分子,引導(dǎo)mIL-15進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中并發(fā)揮其生物學(xué)功能。在重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí),分別在N段加上分泌蛋白VEGFA的信號(hào)肽,用來引導(dǎo)融合蛋白分泌;兩個(gè)蛋白之間加上（GGGGS）₃的linker用來防止兩個(gè)蛋白對(duì)彼此正確折疊的影響;C端加上His-tag標(biāo)簽,用來純化融合蛋白。本論文主要包括以下三部分研究內(nèi)容:（1）利用分子克隆技術(shù),包括雙酶切、PCR、無縫克隆等技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒Migr1-mPD1-mIL-15,經(jīng)過... 

【文章來源】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院上海巴斯德研究所)上海市

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

腫瘤細(xì)胞通過PD-L1與PD1分子的結(jié)合來防止被T細(xì)胞殺傷

基于mPD1和mIL-15重組蛋白靶向腫瘤、提高抗腫瘤免疫的策略30/66abcSignalpeptide3為不同亞克隆產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，符合預(yù)期。293T細(xì)胞是過表達(dá)真核生物蛋白的快捷方式之一，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以短時(shí)間內(nèi)獲得蛋白。鑒于本課題融合蛋白的組成來源于真核生物，且重組質(zhì)粒上含引導(dǎo)分泌的信號(hào)肽部分，所以采用此表達(dá)策略。表達(dá)載體Migr1上含GFP蛋白標(biāo)簽，如圖4分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，空載體和不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，48小時(shí)后檢測(cè)GFP蛋白的表達(dá)水平從而評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。由圖可知相比于不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染重組abM1NFLLSWVHWTLALLLYLHHAKWSQA27SGWLLEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPKPEGRFQGM175GGGGSGGGGSGGGGS190NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS304HHHHHH*PD1extracellularsectionLinkerIL-15extracellularsectionHistag圖2融合蛋白氨基酸序列及模式圖Figure2(a)aminoacidsequenceand(b)modelfigureoffusionprotein空載酶切載體2000bp目的基因?qū)φ?000bp空載重組質(zhì)粒圖3載體雙酶切，目的基因PCR和重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Figure3agarosegelelectrophoresisidentificationresultsof(a)vectordoubledigestion,(b)PCRoftargetgeneand(c)recombinantplasmid

基于mPD1和mIL-15重組蛋白靶向腫瘤、提高抗腫瘤免疫的策略30/66abcSignalpeptide3為不同亞克隆產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，符合預(yù)期。293T細(xì)胞是過表達(dá)真核生物蛋白的快捷方式之一，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可以短時(shí)間內(nèi)獲得蛋白。鑒于本課題融合蛋白的組成來源于真核生物，且重組質(zhì)粒上含引導(dǎo)分泌的信號(hào)肽部分，所以采用此表達(dá)策略。表達(dá)載體Migr1上含GFP蛋白標(biāo)簽，如圖4分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，空載體和不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，48小時(shí)后檢測(cè)GFP蛋白的表達(dá)水平從而評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。由圖可知相比于不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染重組abM1NFLLSWVHWTLALLLYLHHAKWSQA27SGWLLEVPNGPWRSLTFYPAWLTVSEGANATFTCSLSNWSEDLMLNWNRLSPSNQTEKQAAFCNGLSQPVQDARFQIIQLPNRHDFHMNILDTRRNDSGIYLCGAISLHPKAKIEESPGAELVVTERILETSTRYPSPSPKPEGRFQGM175GGGGSGGGGSGGGGS190NWIDVRYDLEKIESLIQSIHIDTTLYTDSDFHPSCKVTAMNCFLLELQVILHEYSNMTLNETVRNVLYLANSTLSSNKNVAESGCKECEELEEKTFTEFLQSFIRIVQMFINTS304HHHHHH*PD1extracellularsectionLinkerIL-15extracellularsectionHistag圖2融合蛋白氨基酸序列及模式圖Figure2(a)aminoacidsequenceand(b)modelfigureoffusionprotein空載酶切載體2000bp目的基因?qū)φ?000bp空載重組質(zhì)粒圖3載體雙酶切，目的基因PCR和重組質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果Figure3agarosegelelectrophoresisidentificationresultsof(a)vectordoubledigestion,(b)PCRoftargetgeneand(c)recombinantplasmid


本文編號(hào)：3227886