目的利用慢病毒載體介導的shRNA-ROR1（Lv-shROR1）建立穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌細胞株,并利用該細胞模型初步研究ROR1調(diào)控腫瘤細胞周期、凋亡和自噬的分子機制,為后續(xù)以ROR1為治療靶點的研究奠定基礎(chǔ)。方法首先,使用帶有綠色熒光蛋白（GFP）標簽的慢病毒介導shRNA-ROR1感染肺腺癌PC9、PC9erlo和NCI-H1975細胞株,利用熒光顯微鏡檢測感染細胞中GFP的熒光信號來衡量慢病毒感染細胞的情況,并采用流式細胞術(shù)檢測Lv-shROR1沉默ROR1蛋白的效率;其次,利用有限稀釋法從Lv-shROR1感染的肺腺癌細胞株中挑選單細胞克隆,進一步利用免疫印跡法、流式細胞術(shù)和RT-PCR檢測克隆細胞株ROR1蛋白和mRNA表達水平進而篩選出一系列穩(wěn)定沉默ROR1的單細胞克隆,作為后續(xù)功能研究的細胞模型;最后,選取PC9erlo單細胞克隆R1進行后續(xù)研究,分別利用免疫印跡法檢測該細胞株中沉默ROR1后細胞周期和凋亡分子水平的變化;利用Ray Bio?C-series Human Autophagy Array 1和免疫印跡法檢測ROR1基因沉默前后自噬分子水平的變化;利用H... 

【文章來源】：成都中醫(yī)藥大學四川省

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略詞表
引言
第一部分 構(gòu)建并鑒定穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌細胞株
    (一)構(gòu)建穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌細胞株
        1 實驗材料
            1.1 細胞株
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗設(shè)備
        2 實驗方法
            2.1 細胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實驗試劑的配制方法
                2.1.2 細胞復蘇
                2.1.3 細胞傳代與細胞換液
                2.1.4 細胞凍存
                2.1.5 廢液處理
            2.2 慢病毒介導shRNA-ROR1 感染肺腺癌細胞株
                2.2.1 細胞接種
                2.2.2 使用不同感染復數(shù)(MOI)值的慢病毒感染肺腺癌細胞株
                2.2.3 熒光顯微鏡檢測慢病毒感染效率
                2.2.4 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株
            2.3 流式細胞術(shù)檢測Lv-shROR1 對肺腺癌細胞株膜蛋白ROR1 的沉默效率
                2.3.1 細胞接種
                2.3.2 流式細胞術(shù)檢測Lv-shROR1 對肺腺癌細胞株細胞膜ROR1 蛋白的沉默效率
                2.3.3 計算Lv-shROR1 對肺腺癌細胞株細胞膜ROR1 蛋白的沉默效率
        3 實驗結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (二)篩選并鑒定穩(wěn)定沉默ROR1的肺腺癌單細胞克隆
        1 實驗材料
            1.1 細胞株
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗設(shè)備
        2 實驗方法
            2.1 細胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實驗試劑的配制方法
                2.1.2 細胞復蘇
                2.1.3 細胞傳代及細胞換液
                2.1.4 細胞凍存
            2.2 有限稀釋法篩選單細胞克隆
            2.3 利用免疫印跡法檢測Lv-shROR1 沉默單細胞克隆ROR1 總蛋白的水平
                2.3.1 細胞接種
                2.3.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.3.3 免疫印跡法檢測Lv-shROR1 沉默單細胞克隆ROR1 總蛋白的水平
                2.3.4 數(shù)據(jù)分析方法
            2.4 利用流式細胞術(shù)檢測Lv-shROR1 抑制膜蛋白ROR1 的表達水平
                2.4.1 細胞接種
                2.4.2 流式細胞術(shù)檢測Lv-shROR1 抑制膜蛋白ROR1 的表達水平
                2.4.3 計算Lv-shROR1 抑制膜蛋白ROR1后ROR1 的表達效率
            2.5 利用RT-PCR檢測Lv-shROR1 沉默ROR1 m RNA的水平
                2.5.1 細胞接種
                2.5.2 RT-PCR檢測Lv-shROR1 沉默ROR1 m RNA的水平
                2.5.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
        3 實驗結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
第二部分 受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)調(diào)控肺腺癌細胞周期、凋亡和自噬的分子機制
    (一)ROR1調(diào)控肺腺癌細胞周期的分子機制
        1 實驗材料
            1.1 細胞株
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗設(shè)備
        2 實驗方法
            2.1 細胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實驗試劑的配制方法
                2.1.2 細胞復蘇
                2.1.3 細胞傳代及細胞換液
                2.1.4 細胞凍存
            2.2 利用免疫印跡法檢測Lv-shROR1 沉默ROR1 細胞周期分子水平的變化
                2.2.1 細胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 免疫印跡法檢測ROR1 調(diào)控肺腺癌細胞周期分子CDK4和Cyclin E1 的表達
            2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
        3 實驗結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (二)ROR1調(diào)控肺腺癌細胞凋亡的分子機制
        1 實驗材料
            1.1 細胞株
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗設(shè)備
        2 實驗方法
            2.1 細胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實驗試劑的配制方法
                2.1.2 細胞復蘇
                2.1.3 細胞傳代及細胞換液
                2.1.4 細胞凍存
            2.2 利用免疫印跡法檢測Lv-shROR1 沉默ROR1 細胞凋亡分子水平的變化
                2.2.1 細胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 免疫印跡法檢測ROR1 調(diào)控肺腺癌細胞凋亡分子Caspase-3、Caspase-7、Bak、Bcl-XL和 Bcl-2 的表達
            2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
        3 實驗結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (三)ROR1調(diào)控肺腺癌細胞自噬的分子機制
        1 實驗材料
            1.1 細胞株
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗設(shè)備
        2 實驗方法
            2.1 細胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實驗試劑的配制方法
                2.1.2 細胞復蘇
                2.1.3 細胞傳代及細胞換液
                2.1.4 細胞凍存
            2.2 利用Ray Bio?C-series Human Autopahgy Array1 檢測ROR1 基因沉默前后肺腺癌細胞株中自噬分子水平的變化
                2.2.1 細胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 利用Ray Bio?C-series Human Autopahgy Array1 檢測ROR1 基因沉默前后肺腺癌細胞株中自噬分子水平的變化
                2.2.4 數(shù)據(jù)分析方法
            2.3 利用免疫印跡法進一步證明ROR1 基因沉默前后肺腺癌細胞株中LC3 A/B分子水平的變化
                2.3.1 細胞接種
                2.3.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.3.3 利用免疫印跡法進一步證明ROR1 基因沉默前后肺腺癌細胞株中LC3 A/B分子水平的變化
                2.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
        3 實驗結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
    (四)ROR1 介導的Akt/GSK-3α/β/m TOR信號通路在肺腺癌中發(fā)揮重要的致病作用
        1 實驗材料
            1.1 細胞株
            1.2 實驗試劑
            1.3 實驗設(shè)備
        2 實驗方法
            2.1 細胞培養(yǎng)
                2.1.1 相關(guān)實驗試劑的配制方法
                2.1.2 細胞復蘇
                2.1.3 細胞傳代及細胞換液
                2.1.4 細胞凍存
            2.2 利用Human Phosphor-kinase Array kit檢測ROR1 基因沉默前后肺腺癌細胞株中關(guān)鍵激酶磷酸化水平變化
                2.2.1 細胞接種
                2.2.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.2.3 利用Human Phospho-kinase Array kit篩選ROR1 基因沉默前后肺腺癌細胞株中關(guān)鍵激酶磷酸化水平變化
                2.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
            2.3 利用免疫印跡法進一步證明ROR1 介導的Akt/GSK-3α/β/m TOR信號通路在肺腺癌中發(fā)揮重要致病作用
                2.3.1 細胞接種
                2.3.2 樣品蛋白的提取與定量
                2.3.3 免疫印跡法檢測ROR1 調(diào)控肺腺癌細胞信號通路分子Akt、P-Akt、GSK-3α/β、m TOR和 P-m TOR的表達
                2.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
            2.4 預(yù)實驗:利用免疫印跡法檢測ROR1 調(diào)控肺腺癌細胞Akt下游關(guān)鍵糖酵解相關(guān)分子HIF-1α分子的表達
        3 實驗結(jié)果
        4 討論與小結(jié)
            4.1 討論
            4.2 小結(jié)
總結(jié)與展望
文獻綜述 探討肺癌新靶標ROR1的作用機制及其臨床運用
致謝
參考文獻
附錄
    附錄1 在讀期間公開發(fā)表的學術(shù)論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Progress in image-guided radiotherapy for the treatment of non-small cell lung cancer[J]. Xiao-Cang Ren,Yue-E Liu,Jing Li,Qiang Lin.  World Journal of Radiology. 2019(03)
[2]ROR1對人肺癌A549細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J]. 王作剛,馮彥,于亮,趙子梁,倪建林,鄒俊卿,黃洋.  腫瘤防治研究. 2018(07)
[3]ROR1激活A(yù)KT/FOXO1信號介導非小細胞肺癌吉非替尼耐藥[J]. 黃洋,馮彥,于亮,趙子梁,鄒俊卿,倪建林,王作剛.  中國生物化學與分子生物學報. 2018(02)
[4]受體酪氨酸激酶樣孤兒受體在腫瘤免疫治療中的研究進展[J]. 王凌菲,王皓.  現(xiàn)代免疫學. 2015(02)



本文編號：3203183