干擾素γ（IFNγ）信號通路在免疫反應、炎性反應、抗腫瘤免疫等過程中發(fā)揮至關重要的作用,其功能狀態(tài)是決定腫瘤免疫治療成敗的關鍵。IFN-γ發(fā)揮作用主要是通過結合膜表面受體IFN-γR并激活其下游的信號分子,調節(jié)相關基因的轉錄和表達。IFN-γR由兩種亞單位組成:IFNγR1（IFNGR1）和IFNγR2（IFNGR2）。IFNGR1在細胞中表達相對過剩,IFNGR2的表達受到機體嚴格的調控。IFNGR2的表達水平直接決定了IFNγ信號通路反應性,因此調控IFNGR2的表達是提高免疫治療效果的潛在突破口,闡明IFNGR2的調控機制有助于深入理解IFNγ信號通路有關的免疫反應和疾病發(fā)生過程,具有潛在的臨床意義。為了發(fā)現(xiàn)調控IFNGR2表達和IFNγ信號通路的基因、小分子化合物等,尋找研究其調控方式及其分子機制的新思路和新策略,本文采用CRISPR/Cas9基因編輯技術,在IFNGR2基因末端原位敲入融合表達的綠色熒光蛋白（EGFP）,建立IFNGR2報告細胞系,通過綠色熒光強度表征活細胞中內源IFNGR2的表達情況,實現(xiàn)對IFNGR2受調控程度的快速、通量化監(jiān)測。我們采取了兩種策略來實現(xiàn)E... 

【文章來源】：軍事科學院北京市

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 腫瘤免疫治療
    1.2 IFNγ信號通路與腫瘤免疫治療
    1.3 基因編輯技術
    1.4 TNF-α和Oxaliplatin在腫瘤治療的研究和應用
第二章 材料及方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 細胞株及菌株
        2.1.2 質粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 試劑配制
    2.2 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 載體的構建
        2.3.2 細胞復蘇、傳代與凍存
        2.3.3 細胞轉染
        2.3.4 細胞嘌呤毒素的篩選濃度的確定
        2.3.5 細胞系Ifngr2-EGFP單克隆細胞系的篩選
        2.3.6 Ifngr2-EGFP敲入細胞系基因組水平的鑒定
        2.3.7 Ifngr2-EGFP敲入細胞蛋白質水平的鑒定
        2.3.8 敲入細胞系細胞因子和藥物處理的功能性驗證
        2.3.9 統(tǒng)計學檢驗
第三章 實驗結果
    3.1 敲入位點的設計
        3.1.1 基因信息的獲取
        3.1.2 sgRNA的設計及實驗流程
    3.2 敲入載體的構建
        3.2.1 微同源末端連接法載體的構建
        3.2.2 同源重組法載體的構建
    3.3 敲入細胞系的篩選與鑒定
        3.3.1 細胞系構建和篩選方法的建立
        3.3.2 敲入細胞克隆的鑒定
    3.4 B16-Ifngr2-EGFP細胞系可以響應IFNγ刺激
    3.5 TNFα和Oxaliplatin促進B16 敲入細胞系Ifngr2 和EGFP表達
        3.5.1 TNFα上調Ifngr2和EGFP的表達
        3.5.2 奧沙利鉑促進Ifngr2和EGFP的表達
        3.5.3 IFNγ不影響Ifngr2和EGFP的表達
第四章 討論
參考文獻
作者在學期間取得的學術成果
主要簡歷
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]腫瘤免疫治療的研究現(xiàn)狀及應用[J]. 王貝茹,張思遠,魏陳秋.  中外醫(yī)學研究. 2019(22)
[2]腫瘤免疫檢查點抑制劑臨床治療的研究進展[J]. 許標波,賀毅憬,王韋力,周成芳,謝商宸,沈冬亞,Howard L.Mcleod.  中國臨床藥理學與治療學. 2016(02)



本文編號：3170283