干擾素γ（IFNγ）信號(hào)通路在免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、抗腫瘤免疫等過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,其功能狀態(tài)是決定腫瘤免疫治療成敗的關(guān)鍵。IFN-γ發(fā)揮作用主要是通過(guò)結(jié)合膜表面受體IFN-γR并激活其下游的信號(hào)分子,調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。IFN-γR由兩種亞單位組成:IFNγR1（IFNGR1）和IFNγR2（IFNGR2）。IFNGR1在細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)過(guò)剩,IFNGR2的表達(dá)受到機(jī)體嚴(yán)格的調(diào)控。IFNGR2的表達(dá)水平直接決定了IFNγ信號(hào)通路反應(yīng)性,因此調(diào)控IFNGR2的表達(dá)是提高免疫治療效果的潛在突破口,闡明IFNGR2的調(diào)控機(jī)制有助于深入理解IFNγ信號(hào)通路有關(guān)的免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生過(guò)程,具有潛在的臨床意義。為了發(fā)現(xiàn)調(diào)控IFNGR2表達(dá)和IFNγ信號(hào)通路的基因、小分子化合物等,尋找研究其調(diào)控方式及其分子機(jī)制的新思路和新策略,本文采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),在IFNGR2基因末端原位敲入融合表達(dá)的綠色熒光蛋白（EGFP）,建立IFNGR2報(bào)告細(xì)胞系,通過(guò)綠色熒光強(qiáng)度表征活細(xì)胞中內(nèi)源IFNGR2的表達(dá)情況,實(shí)現(xiàn)對(duì)IFNGR2受調(diào)控程度的快速、通量化監(jiān)測(cè)。我們采取了兩種策略來(lái)實(shí)現(xiàn)E... 

【文章來(lái)源】：軍事科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 腫瘤免疫治療
    1.2 IFNγ信號(hào)通路與腫瘤免疫治療
    1.3 基因編輯技術(shù)
    1.4 TNF-α和Oxaliplatin在腫瘤治療的研究和應(yīng)用
第二章 材料及方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞株及菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 試劑配制
    2.2 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 載體的構(gòu)建
        2.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存
        2.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        2.3.4 細(xì)胞嘌呤毒素的篩選濃度的確定
        2.3.5 細(xì)胞系Ifngr2-EGFP單克隆細(xì)胞系的篩選
        2.3.6 Ifngr2-EGFP敲入細(xì)胞系基因組水平的鑒定
        2.3.7 Ifngr2-EGFP敲入細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的鑒定
        2.3.8 敲入細(xì)胞系細(xì)胞因子和藥物處理的功能性驗(yàn)證
        2.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)
第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 敲入位點(diǎn)的設(shè)計(jì)
        3.1.1 基因信息的獲取
        3.1.2 sgRNA的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)流程
    3.2 敲入載體的構(gòu)建
        3.2.1 微同源末端連接法載體的構(gòu)建
        3.2.2 同源重組法載體的構(gòu)建
    3.3 敲入細(xì)胞系的篩選與鑒定
        3.3.1 細(xì)胞系構(gòu)建和篩選方法的建立
        3.3.2 敲入細(xì)胞克隆的鑒定
    3.4 B16-Ifngr2-EGFP細(xì)胞系可以響應(yīng)IFNγ刺激
    3.5 TNFα和Oxaliplatin促進(jìn)B16 敲入細(xì)胞系Ifngr2 和EGFP表達(dá)
        3.5.1 TNFα上調(diào)Ifngr2和EGFP的表達(dá)
        3.5.2 奧沙利鉑促進(jìn)Ifngr2和EGFP的表達(dá)
        3.5.3 IFNγ不影響Ifngr2和EGFP的表達(dá)
第四章 討論
參考文獻(xiàn)
作者在學(xué)期間取得的學(xué)術(shù)成果
主要簡(jiǎn)歷
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]腫瘤免疫治療的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用[J]. 王貝茹,張思遠(yuǎn),魏陳秋.  中外醫(yī)學(xué)研究. 2019(22)
[2]腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑臨床治療的研究進(jìn)展[J]. 許標(biāo)波,賀毅憬,王韋力,周成芳,謝商宸,沈冬亞,Howard L.Mcleod.  中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué). 2016(02)



本文編號(hào)：3170283