研究目的腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率長(zhǎng)期處于增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。2018年全球腎癌新發(fā)病例約40萬,死亡病例約17萬;在中國(guó)腎癌新發(fā)病例約7萬,死亡病例約4.3萬。腎癌患者中約有30%初診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移,還有約25%局限性腎癌患者術(shù)后會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移部位以肺部最為常見。目前轉(zhuǎn)移性腎癌患者的治療手段仍然有限,預(yù)后亦較差,腎癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。近來研究表明腫瘤細(xì)胞來源的外泌體能通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成,從而在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用,但是腎癌細(xì)胞外泌體是否能夠通過介導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成進(jìn)而影響腎癌肺轉(zhuǎn)移過程,相關(guān)分子機(jī)制如何,目前仍有待闡明。本研究擬探討腎癌細(xì)胞外泌體在腎癌肺轉(zhuǎn)移過程中的功能以及相關(guān)分子機(jī)制,為腎癌肺轉(zhuǎn)移患者尋找新的潛在診斷標(biāo)志物以及干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。研究方法1.采用超速離心方法提取低轉(zhuǎn)移性腎癌細(xì)胞786-O和高轉(zhuǎn)移性腎癌細(xì)胞SN12-PM6來源的外泌體,標(biāo)記為786-O-exo和SN12-PM6-exo,利用NTA（nanoparticle tracking analysis）、透射電鏡以及蛋白免疫印跡等方法對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定分析... 

【文章來源】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：109 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

1腎癌細(xì)胞外泌體的鑒定分析A.NTA分析786-O和SN12-PM6腎癌細(xì)胞外泌

腎癌細(xì)胞外泌體在腎癌肺轉(zhuǎn)移中的功能及機(jī)制研究-33-體的大小分布情況以及外泌體濃度；exo為外泌體exosomes的簡(jiǎn)寫形式。B.透射電鏡分析腎癌細(xì)胞外泌體的形態(tài)和大校C.Westernblot檢測(cè)腎癌細(xì)胞及其分泌的外泌體中Alix、TSG101以及CD63等外泌體特征性蛋白分子的表達(dá)情況。D.相同數(shù)目的高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性腎癌細(xì)胞分泌的外泌體樣本總蛋白含量的比較。Figure1.1.1IdentificationandanalysisofexosomesderivedfromRCCcellsA.AnalysisoftheparticlessizedistributionandconcentrationsofexosomesderivedfromRCCcellsbyNTA;exoindicatesexosomes.B.TransmissionelectronmicroscopeanalysisofthemorphologyandsizeofexosomesderivedfromRCCcells.C.WesternblotanalysisoftheexpressionofAlix,TSG101andCD63inRCCcellsandtheirexosomes.D.ComparisonoftotalproteinlevelsofexosomesamplessecretedbythesamenumberofhighlymetastaticandlowmetastaticRCCcells;RCC,renalcellcarcinoma.接著，為了驗(yàn)證腎癌細(xì)胞外泌體在肺部的分布情況，我們經(jīng)小鼠尾靜脈注入熒光染料PKH67標(biāo)記后的腎癌細(xì)胞外泌體溶液，然后分別在0、24、48小時(shí)后取出小鼠肺組織，利用熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)腎癌細(xì)胞外泌體在肺組織中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腎癌細(xì)胞外泌體注入小鼠體內(nèi)24及48小時(shí)之后均可在肺部觀察到明顯熒光信號(hào)（圖1.1.2），這提示腎癌細(xì)胞外泌體能夠通過血液循環(huán)在肺部明顯富集。圖1.1.2熒光成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)腎癌細(xì)胞外泌體在肺部的分布情況Figure1.1.2ThedistributionofPKH67-labeledexosomesderivedfromRCCcellsinthelungswasdynamicallytracedbyexvivofluorescentimagingsystem.

腎癌細(xì)胞外泌體在腎癌肺轉(zhuǎn)移中的功能及機(jī)制研究-34-由于外泌體主要通過傳遞其內(nèi)容物至受體細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，因此，接下來我們將探索肺組織中攝取腎癌細(xì)胞外泌體的細(xì)胞類型。首先，我們通過熒光共定位實(shí)驗(yàn)分析肺組織中各類細(xì)胞攝取腎癌細(xì)胞外泌體的情況。經(jīng)小鼠尾靜脈注入熒光染料PKH67標(biāo)記后的腎癌細(xì)胞外泌體溶液，24小時(shí)后即取出小鼠肺組織制成肺組織快速冰凍切片，然后進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織中EpCAM+肺上皮細(xì)胞、CD31+內(nèi)皮細(xì)胞、S100A4+成纖維細(xì)胞以及F4/80+巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞對(duì)腎癌細(xì)胞外泌體的攝取情況。通過熒光共聚焦顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)其中S100A4+肺成纖維細(xì)胞（紅色熒光）能夠攝取綠色熒光標(biāo)記的腎癌細(xì)胞外泌體，而其他三種細(xì)胞中均未見攝取的外泌體熒光信號(hào)（圖1.1.3A）。接著，為了進(jìn)一步明確肺成纖維細(xì)胞對(duì)腎癌細(xì)胞外泌體的攝取，我們進(jìn)行了體外外泌體攝取實(shí)驗(yàn)。將綠色熒光染料PHK67標(biāo)記腎癌細(xì)胞外泌體溶液SN12-PM6-exo和786-O-exo，然后分別加入紅色熒光染料PKH26標(biāo)記的人肺成纖維細(xì)胞MRC-5的培養(yǎng)基中，24小時(shí)后通過熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)SN12-PM6-exo和786-O-exo均能被肺成纖維細(xì)胞MRC-5攝�。▓D1.1.3B）。因此，上述體內(nèi)和體外外泌體攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺成纖維細(xì)胞可能為肺組織中攝取腎癌細(xì)胞外泌體的主要細(xì)胞類型。圖1.1.3腎癌細(xì)胞外泌體被肺成纖維細(xì)胞攝取A.熒光共聚焦顯微鏡觀察肺組織冰凍切


本文編號(hào)：3106592