研究目的腎細胞癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率長期處于增長態(tài)勢。2018年全球腎癌新發(fā)病例約40萬,死亡病例約17萬;在中國腎癌新發(fā)病例約7萬,死亡病例約4.3萬。腎癌患者中約有30%初診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移,還有約25%局限性腎癌患者術(shù)后會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移部位以肺部最為常見。目前轉(zhuǎn)移性腎癌患者的治療手段仍然有限,預(yù)后亦較差,腎癌發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機制仍不清楚。近來研究表明腫瘤細胞來源的外泌體能通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成,從而在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用,但是腎癌細胞外泌體是否能夠通過介導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成進而影響腎癌肺轉(zhuǎn)移過程,相關(guān)分子機制如何,目前仍有待闡明。本研究擬探討腎癌細胞外泌體在腎癌肺轉(zhuǎn)移過程中的功能以及相關(guān)分子機制,為腎癌肺轉(zhuǎn)移患者尋找新的潛在診斷標志物以及干預(yù)靶點提供理論依據(jù)。研究方法1.采用超速離心方法提取低轉(zhuǎn)移性腎癌細胞786-O和高轉(zhuǎn)移性腎癌細胞SN12-PM6來源的外泌體,標記為786-O-exo和SN12-PM6-exo,利用NTA（nanoparticle tracking analysis）、透射電鏡以及蛋白免疫印跡等方法對外泌體進行鑒定分析... 

【文章來源】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)上海市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：109 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

1腎癌細胞外泌體的鑒定分析A.NTA分析786-O和SN12-PM6腎癌細胞外泌

腎癌細胞外泌體在腎癌肺轉(zhuǎn)移中的功能及機制研究-33-體的大小分布情況以及外泌體濃度；exo為外泌體exosomes的簡寫形式。B.透射電鏡分析腎癌細胞外泌體的形態(tài)和大校C.Westernblot檢測腎癌細胞及其分泌的外泌體中Alix、TSG101以及CD63等外泌體特征性蛋白分子的表達情況。D.相同數(shù)目的高轉(zhuǎn)移性和低轉(zhuǎn)移性腎癌細胞分泌的外泌體樣本總蛋白含量的比較。Figure1.1.1IdentificationandanalysisofexosomesderivedfromRCCcellsA.AnalysisoftheparticlessizedistributionandconcentrationsofexosomesderivedfromRCCcellsbyNTA;exoindicatesexosomes.B.TransmissionelectronmicroscopeanalysisofthemorphologyandsizeofexosomesderivedfromRCCcells.C.WesternblotanalysisoftheexpressionofAlix,TSG101andCD63inRCCcellsandtheirexosomes.D.ComparisonoftotalproteinlevelsofexosomesamplessecretedbythesamenumberofhighlymetastaticandlowmetastaticRCCcells;RCC,renalcellcarcinoma.接著，為了驗證腎癌細胞外泌體在肺部的分布情況，我們經(jīng)小鼠尾靜脈注入熒光染料PKH67標記后的腎癌細胞外泌體溶液，然后分別在0、24、48小時后取出小鼠肺組織，利用熒光成像系統(tǒng)檢測腎癌細胞外泌體在肺組織中的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腎癌細胞外泌體注入小鼠體內(nèi)24及48小時之后均可在肺部觀察到明顯熒光信號（圖1.1.2），這提示腎癌細胞外泌體能夠通過血液循環(huán)在肺部明顯富集。圖1.1.2熒光成像系統(tǒng)動態(tài)檢測腎癌細胞外泌體在肺部的分布情況Figure1.1.2ThedistributionofPKH67-labeledexosomesderivedfromRCCcellsinthelungswasdynamicallytracedbyexvivofluorescentimagingsystem.

腎癌細胞外泌體在腎癌肺轉(zhuǎn)移中的功能及機制研究-34-由于外泌體主要通過傳遞其內(nèi)容物至受體細胞介導(dǎo)細胞間的信息交流，因此，接下來我們將探索肺組織中攝取腎癌細胞外泌體的細胞類型。首先，我們通過熒光共定位實驗分析肺組織中各類細胞攝取腎癌細胞外泌體的情況。經(jīng)小鼠尾靜脈注入熒光染料PKH67標記后的腎癌細胞外泌體溶液，24小時后即取出小鼠肺組織制成肺組織快速冰凍切片，然后進行免疫熒光實驗檢測肺組織中EpCAM+肺上皮細胞、CD31+內(nèi)皮細胞、S100A4+成纖維細胞以及F4/80+巨噬細胞等多種細胞對腎癌細胞外泌體的攝取情況。通過熒光共聚焦顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)其中S100A4+肺成纖維細胞（紅色熒光）能夠攝取綠色熒光標記的腎癌細胞外泌體，而其他三種細胞中均未見攝取的外泌體熒光信號（圖1.1.3A）。接著，為了進一步明確肺成纖維細胞對腎癌細胞外泌體的攝取，我們進行了體外外泌體攝取實驗。將綠色熒光染料PHK67標記腎癌細胞外泌體溶液SN12-PM6-exo和786-O-exo，然后分別加入紅色熒光染料PKH26標記的人肺成纖維細胞MRC-5的培養(yǎng)基中，24小時后通過熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)SN12-PM6-exo和786-O-exo均能被肺成纖維細胞MRC-5攝取（圖1.1.3B）。因此，上述體內(nèi)和體外外泌體攝取實驗結(jié)果表明肺成纖維細胞可能為肺組織中攝取腎癌細胞外泌體的主要細胞類型。圖1.1.3腎癌細胞外泌體被肺成纖維細胞攝取A.熒光共聚焦顯微鏡觀察肺組織冰凍切


本文編號：3106592