【研究背景】截至2015年,在中國范圍內(nèi)胃癌的發(fā)生率和死亡率都位居前五,表明胃癌依然是一個嚴(yán)峻的影響人民生命健康的因素。目前胃癌的免疫治療得到了快速發(fā)展,并且也取得了一定的臨床治療效果,但是依然沒有達到人們所預(yù)期的效果,這可能還有其他的因素干擾了免疫治療。幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)生發(fā)展的一個關(guān)鍵因素,其中主要發(fā)揮致癌作用的是細(xì)胞毒素相關(guān)抗原（CagA）蛋白,是HP通過特異性IV型分泌系統(tǒng)分泌至細(xì)胞中。研究表明CagA可以引起KLF4在胃癌中的低表達,并且其機制研究表明CagA可以通過KLF4啟動子區(qū)的甲基化,以及MIR155途徑導(dǎo)致KLF4的表達沉寂或失活。KLF4是一個含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,研究已經(jīng)表明KLF4在胃癌中起到抑癌基因的作用,并且已被證實,研究其失活機制對于胃癌治療至關(guān)重要。我們課題組前期主要研究了CagA導(dǎo)致KLF4失活的機制,那么抑癌蛋白KLF4的低表達或丟失與促進胃癌發(fā)展之間的具體機制是什么呢?CXCL8是趨化因子家族的一種細(xì)胞因子,與特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用,參與多種炎癥反應(yīng),主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌。研究表明HP胃黏膜上皮細(xì)胞24h后全基因組中CXCL8是唯一一個... 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

胃癌在組織中KLF4低表達，CXCL8高表達

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士論文36圖2.H.pylori感染或CagA基因轉(zhuǎn)染后誘導(dǎo)CXCL8表達。（A,B,C）GES-1,AGS,MGC-803與幽門螺桿菌共培養(yǎng)增強了CXCL8的表達。（D,E,F）GES-1,AGS,MGC-803轉(zhuǎn)染CagA（1.5ug）同樣增強了CXCL8的表達。Figure2.H.pyloriinfectionorCagAtransfectioninducesCXCL8overexpression.(A)TheGES-1normalgastricmucosalepithelialcelllinewascoculturedwithH.pyloriatdifferentconcentrations.After48h,CXCL8RNAlevelswereincreased(A,leftpanel),whileCXCL8proteinlevelswerealsoupregulated(A,rightpanel).(B,C)AGS/MGC803gastriccancercellswerecoculturedwithH.pylori,andCXCL8RNAandproteinlevelswereupregulated.(D,E,F)CagA(1.5ug)wastransfectedintotheGES-1/AGS/MGC803celllines,andafter48h,CXCL8proteinandRNAlevelsweresignificantlyupregulated.Theexperimentswereperformedindependentlythreetimes.3.3KLF4在體外抑制CXCL8表達并抑制CXCL8誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞惡性行為變化。在我們之前的研究中，我們知道幽門螺桿菌降低了KLF4的表達，這與幽門螺桿菌在胃癌細(xì)胞中促進CXCL8的高表達相反。針對這個問題，我們研究了體外胃癌細(xì)胞中CXCL8和KLF4之間的相互作用。將KLF4過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入兩個胃癌細(xì)胞(AGS,MGC-803)中，處理48h后收集細(xì)胞和細(xì)胞上清液，通過Qrt-pcr和

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士論文39在功能性。當(dāng)HA-KLF4表達載體轉(zhuǎn)染到AGS細(xì)胞中時，染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）顯示與CXCL8啟動子區(qū)域結(jié)合的KLF4蛋白顯著增加（圖4D），表明KLF4蛋白能夠與CXCL8啟動子區(qū)結(jié)合。因此KLF4能夠抑制CXCL8的表達，在胃癌中CXCL8是KLF4的重要下游靶基因。圖4.KLF4負(fù)向調(diào)節(jié)CXCL8。（A）構(gòu)建的CXCL8啟動子報告基因及其三個突變體報告基因載體。（B,C）將KLF4表達載體與CXCL8啟動子報告基因及其三個突變報告基因載體共轉(zhuǎn)染至GES-1和胃癌細(xì)胞AGS中，利用雙熒光素酶報告基因檢測CXCL8啟動子報告基因活性。（D）將HA-KLF4表達載體轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞中，利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測KLF4與CXCL8啟動子區(qū)是否結(jié)合。Figure4.NegativeregulationofCXCL8expressionbyKLF4(A)Schematicofthefull-lengthCXCL8promoterreporteranditsmutantconstructs.TwopotentialKLF4-bindingsitesareindicated.Vectorscontainingwild-typeandthreesite-specificmutatedCXCL8promotersequencesandaluciferasereportergenewereconstructedandnamedWT,Site1,Site2,andDoublesite.(B)TheCXCL8promoteractivityinGES-1cellsat48haftertransfectionwiththepcDNA3.1-KLF4vectorisshown.(C)Similarly,theCXCL8promoterwascotransfectedwiththepcDNA3.1-KLF4vectorintoAGScells.(D)ChIPanalysisofKLF4bindingtotheCXCL8promoterregionwithapotentialKLF4-bindingsiteinAGSgastriccancercell.Theexperimentswereperformedindependentlythreetimes.

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3032934