發(fā)布時(shí)間：2021-01-31 00:24

　　惡性腫瘤作為全球最大的公共衛(wèi)生問題之一,極大地危害著人類健康,而血管形成對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。半乳凝集素-3（Galectin-3,簡(jiǎn)稱Gal-3）,作為半乳凝集素家族唯一嵌合體成員,具有多種功能,尤其是在促血管形成方面。目前,關(guān)于Gal-3促血管形成的研究已報(bào)道了幾個(gè)受體,但并不能完全解釋清楚Gal-3促血管形成的機(jī)制。內(nèi)皮細(xì)胞遷移是血管形成的關(guān)鍵,因此本論文利用人表皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1,從功能受體及其作用機(jī)制兩方面研究了Gal-3對(duì)HMEC-1遷移的影響及機(jī)制,研究結(jié)果和創(chuàng)新點(diǎn)如下:第一,利用Transwell細(xì)胞遷移方法,檢測(cè)了Gal-3及其截短蛋白對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響,發(fā)現(xiàn)Gal-3（1-250 aa）以糖依賴的方式促進(jìn)細(xì)胞遷移。首次發(fā)現(xiàn)Gal-3的C-端（111-250 aa,Carbohydrate Recognition Domain,CRD）也以相同的方式促進(jìn)細(xì)胞遷移,而單獨(dú)的N-端（1-108 aa,N-terminal tail,NT）對(duì)細(xì)胞遷移無(wú)影響。此外,還發(fā)現(xiàn)Gal-3和CRD不論是在游離態(tài),還是固定態(tài),均能促進(jìn)細(xì)胞遷移且作用相... 

【文章來(lái)源】：東北師范大學(xué)吉林省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：110 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文對(duì)照及英文縮寫詞表
第一章 前言
    1.1 半乳凝集素
    1.2 半乳凝集素-3概述
    1.3 Gal-3的結(jié)構(gòu)
    1.4 Gal-3的修飾、分布及存在形式
    1.5 Gal-3的功能
        1.5.1 Gal-3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用
        1.5.2 Gal-3在細(xì)胞凋亡中的作用
        1.5.3 Gal-3在細(xì)胞增殖和分化中的作用
        1.5.4 Gal-3在細(xì)胞黏附中的作用
        1.5.5 Gal-3在血管形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用
        1.5.6 CRD功能概述
    1.6 Gal-3受體
        1.6.1 Integrin簡(jiǎn)介
        1.6.2 免疫球蛋白超家族及CD146簡(jiǎn)介
    1.7 論文立題依據(jù)、研究?jī)?nèi)容、目的及意義
第二章 Gal-3對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響及相關(guān)受體篩選
    2.1 材料、試劑和設(shè)備
        2.1.1 材料
        2.1.2 主要試劑和配制
        2.1.3 主要儀器和耗材
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.2 pET-28a（+）-Gal-3,pET-28a（+）-CRD和pET-28a（+）-NT質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.3 蛋白質(zhì)的大量制備
        2.2.4 細(xì)胞的復(fù)蘇
        2.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
        2.2.6 細(xì)胞凍存
        2.2.7 蛋白定量及SDS-PAGE和WesternBlot實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 細(xì)胞遷移
        2.2.9 慢病毒載體的構(gòu)建
        2.2.10 慢病毒的包裝
        2.2.11 目的細(xì)胞的感染
        2.2.12 細(xì)胞膜分離
        2.2.13 免疫共沉淀法
        2.2.14 硝酸銀染色法及質(zhì)譜檢測(cè)
        2.2.15 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 His-Gal-3、His-CRD和His-NT蛋白的純化結(jié)果
        2.3.2 Gal-3對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響
        2.3.3 Gal-3不同截短蛋白對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響
        2.3.4 CRD對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響
        2.3.5 Gal-3和CRD促進(jìn)HMEC-1細(xì)胞遷移具有細(xì)胞密度依賴性
        2.3.6 游離態(tài)和固定態(tài)的Gal-3和CRD對(duì)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響
        2.3.7 LPS對(duì)Gal-3和CRD誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞遷移的影響
        2.3.8 .αvintegrin在Gal-3誘導(dǎo)細(xì)胞遷移中的作用
        2.3.9 EGFR和VEGFR2在Gal-3誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞遷移中的作用
        2.3.10 篩選HMEC-1細(xì)胞膜上未知的Gal-3受體
        2.3.11 質(zhì)譜分析結(jié)果
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 β1integrin在Gal-3和CRD誘導(dǎo)HMEC-1遷移中的作用及機(jī)制
    3.1 材料、試劑及儀器
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要試劑及配制
        3.1.3 主要儀器和耗材
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.2 GST、GST-Gal-3及GST-CRD蛋白的制備
        3.2.3 慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.4 慢病毒的包裝
        3.2.5 目的細(xì)胞的感染
        3.2.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)
        3.2.7 細(xì)胞遷移及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
        3.2.8 Pulldown方法
        3.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 Gal-3和CRD與β1integrin作用
        3.3.2 β1integrin在Gal-3和CRD誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞遷移中的作用
        3.3.3 敲低β1integrin對(duì)αintegrin亞基表達(dá)的影響
        3.3.4 αintegrin亞基與Gal-3的相互作用
        3.3.5 αintegrin亞基在Gal-3及CRD誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞遷移中的作用
        3.3.6 β1integrin在Gal-3和CRD誘導(dǎo)HMEC-1遷移的作用機(jī)制研究
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 CD146在Gal-3誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞遷移中的作用及與Gal-3作用的分子機(jī)制
    4.1 材料、試劑及儀器
        4.1.1 材料
        4.1.2 主要試劑及配制
        4.1.3 主要儀器及耗材
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
        4.2.3 細(xì)胞凍存
        4.2.4 CD146胞外段及其胞外段截短蛋白的大量制備
        4.2.5 質(zhì)譜分析CD146的糖基化位點(diǎn)及糖型
        4.2.6 Pulldown方法檢測(cè)CD146與Gal-3及CRD的直接作用
        4.2.7 生物膜干涉法檢測(cè)CD146與Gal-3的親和力大小
        4.2.8 免疫共沉淀法檢測(cè)CD146及D1-D4蛋白與Gal-3的作用
        4.2.9 慢病毒包裝
        4.2.10 RT-PCR
        4.2.11 細(xì)胞遷移及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 CD146在Gal-3誘導(dǎo)HMEC-1細(xì)胞遷移中的作用
        4.3.2 Gal-3對(duì)CD146mRNA表達(dá)的影響
        4.3.3 Gal-3對(duì)CD146蛋白表達(dá)的影響
        4.3.4 Gal-3對(duì)CD146蛋白二聚化的影響
        4.3.5 CD146與Gal-3的相互作用
        4.3.6 CD146蛋白的表達(dá)及純化
        4.3.7 CD146蛋白在溶液中的存在形態(tài)
        4.3.8 CD146與Gal-3在分子水平的作用
        4.3.9 CD146胞外段截短蛋白的表達(dá)及純化
        4.3.10 D1-D4蛋白在溶液中的存在形態(tài)
        4.3.11 Domain5是CD146與Gal-3作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域
        4.3.12 CD146胞外段蛋白的糖基化位點(diǎn)
        4.3.13 CD146胞外段蛋白的糖鏈分析
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
博士期間發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Knockdown of CD146 reduces the migration and proliferation of human endothelial cells[J]. Yanyong Kang~(1,3) Fengcai Wang~(1,2) Jing Feng~1 Dongling Yang~1 Xu Yang~3 Xiyun Yan~11 National Laboratory of Biomacromolecules,Institute of Biophysics,Chinese Academy of Science Beijing 100101,China;2 Chemistry Department,Anyang teacher’s College,Anyang 455000,China;3 College of Life Science,Central China Normal University,Wuhan 430079,China.  Cell Research. 2006(03)



本文編號(hào)：3009860