肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的常見(jiàn)原因�？绾四た寡趸D(zhuǎn)錄因子Nrf1（nuclear factor-erythroid 2 p45 submit-related factor 1）是Cnc-bZIP（cap‘n’collar basic-region leucine zipper）即Cnc堿性亮氨酸拉鏈亞家族成員之一,通過(guò)調(diào)控下游抗氧化酶、解毒酶、26s蛋白酶體亞基基因的轉(zhuǎn)錄,保護(hù)細(xì)胞和組織免受氧化應(yīng)激的影響,引發(fā)細(xì)胞進(jìn)行適應(yīng)性變化以維持機(jī)體內(nèi)平衡。研究證實(shí)在成年小鼠肝臟特異敲除Nrf1會(huì)誘發(fā)肝細(xì)胞癌[1,2]。O連接的N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc）單糖修飾是細(xì)胞為滿(mǎn)足不同生物學(xué)功能需要,進(jìn)行的快速、可逆、動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,由體內(nèi)的唯一的O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶（O-GlcNAc Transferase,OGT）催化進(jìn)行。O-GlcNAc修飾的異常與腫瘤發(fā)生、遷移和侵襲過(guò)程密切相關(guān),在肝細(xì)胞癌形成和發(fā)展中起著重要作用[3]。近期液相色譜-光譜法檢測(cè)提示... 

【文章來(lái)源】：重慶大學(xué)重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：109 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮略詞表
1 前言
    1.1 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.1.1 肝細(xì)胞癌的概況
        1.1.2 轉(zhuǎn)錄因子Nrf1研究進(jìn)展
        1.1.3 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路與肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移
        1.1.4 O-GlcNAc修飾研究概況
    1.2 課題的主要研究?jī)?nèi)容
    1.3 本文創(chuàng)新點(diǎn)
2 敲減hNrf1/TCF11對(duì)肝癌生物學(xué)行為的影響
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞系
        2.1.2 慢病毒載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 慢病毒包裝及轉(zhuǎn)導(dǎo)
        2.2.3 Western Blot
        2.2.4 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
        2.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)
        2.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期
        2.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        2.2.8 細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)）
        2.2.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 穩(wěn)定敲減hNrf1/TCF11的HepG2、MHCC97H、MHCC97L肝癌細(xì)胞系的建立
        2.3.2 穩(wěn)定敲減hNrf1/TCF1對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖的影響
        2.3.3 敲減Nrf1對(duì)肝癌細(xì)胞遷移及侵襲力的作用
    2.4 討論
3 敲減hNrf1/TCF11對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲影響的機(jī)制
    3.1 材料
        3.1.1 主要材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.2 數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序
        3.2.3 細(xì)胞總RNA提取
        3.2.4 反轉(zhuǎn)錄
        3.2.5 qPCR實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)
        3.2.7 Western-blot實(shí)驗(yàn)
        3.2.8 放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)
        3.2.9 泛素化實(shí)驗(yàn)
        3.2.10 細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提
        3.2.11 裸鼠尾靜脈注射肺部轉(zhuǎn)移模型建立
        3.2.12 SABC法免疫組織化學(xué)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 敲減hNrf1/TCF11能激活b-Catenin通路
        3.3.2 敲減hNrf1能增加b-Catenin的核累積
        3.3.3 敲減hNrf1/TCF11對(duì)裸鼠尾靜脈荷瘤肺部轉(zhuǎn)移的影響
    3.4 討論
4 O-Glc NAc修飾對(duì)Nrf1的影響及其在肝癌發(fā)生中的作用
    4.1 材料
        4.1.1 主要材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.2.2 細(xì)胞總RNA提取
        4.2.3 反轉(zhuǎn)錄
        4.2.4 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)
        4.2.5 Western-blot實(shí)驗(yàn)
        4.2.6 GST-Pull-Down實(shí)驗(yàn)
        4.2.7 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)
        4.2.8 免疫共沉淀及泛素化實(shí)驗(yàn)
        4.2.9 放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)
    4.3 實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 細(xì)胞內(nèi)O-GlcNAc狀態(tài)能影響hNrf1/TCF11的豐度
        4.3.2 OGT與Nrf1在體外、細(xì)胞內(nèi)均能相互作用
        4.3.3 敲減OGT能增加Nrf1及其靶基因的表達(dá)
        4.3.4 過(guò)表達(dá)OGT能減少Nrf1的表達(dá)并降低其轉(zhuǎn)錄活性
        4.3.5 O-GlcNAc能影響Nrf1的泛素化降解
        4.3.6 O-GlcNAc可能修飾Nrf1的區(qū)域
    4.4 討論
5 主要結(jié)論與后續(xù)研究
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 后續(xù)研究
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
    A 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文
    B 作者在攻讀博士學(xué)位期間參加的科研項(xiàng)目
    C 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列表


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Sonic Hedgehog signaling pathway in primary liver cancer cells[J]. Lian-Yi Guo,Pei Liu,Ying Wen,Wei Cui,Ying Zhou.  Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2014(09)



本文編號(hào)：3009785