肺癌是目前全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌的主要組織學(xué)類型,占全部肺癌的85%左右。大多數(shù)肺癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期,預(yù)后較差。近年來,以表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI）吉非替尼（Gefitinib）為代表的分子靶向藥物取代傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性藥物,在晚期NSCLC EGFR敏感突變（主要包括19外顯子缺失突變、21外顯子L858R點(diǎn)突變）患者的治療中獲得巨大成功。然而,經(jīng)過一段時(shí)間的治療（中位時(shí)間8-12個(gè)月）大多數(shù)患者會(huì)對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生獲得性耐藥,因而限制了其臨床應(yīng)用和療效,成為晚期NSCLC靶向治療亟待解決的關(guān)鍵問題之一。許多研究證實(shí)EGFR-TKI耐藥與EGFR二次突變、旁路激活、表型轉(zhuǎn)換等有關(guān)。針對(duì)已發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制,EGFR-TKI已在不斷更新?lián)Q代,而且臨床上也在發(fā)展各種聯(lián)合化療方案,但效果仍不盡人意。因此,探尋新的耐藥機(jī)制仍任重道遠(yuǎn)。... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

EGFR-TKIs獲得性耐藥肺腺癌細(xì)胞株高表達(dá)CA916798（A)CCK-8法檢測(cè)吉非替尼敏感株P(guān)C9和獲得性耐藥株P(guān)C9/GR對(duì)吉非替尼的IC50（上圖）

第三章CA916798促進(jìn)NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI耐藥的作用25靶向CA916798的shRNA序列和1條無意序列（scramble，mock)的慢病毒分別感染NSCLC細(xì)胞，經(jīng)過嘌呤霉素的篩選獲得穩(wěn)定敲低CA916798的細(xì)胞。經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)相對(duì)于mock細(xì)胞，shRNA在PC9/GR細(xì)胞和HCC827/IR細(xì)胞中敲低CA96798的效率均大于70%（圖3-2A），經(jīng)Westernblot驗(yàn)證，該shRNA也能在蛋白水平上顯著敲低CA916798的表達(dá)（圖1-2B)，將經(jīng)過該shRNA感染、篩選后的細(xì)胞命名為shCA916798（簡(jiǎn)寫為shCA），并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用含CA916798全長(zhǎng)序列質(zhì)粒和空載體（control)質(zhì)粒包裝的慢病毒感染對(duì)藥物敏感的NSCLC細(xì)胞，經(jīng)過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定過表達(dá)CA916798細(xì)胞。qRT-PCR驗(yàn)證顯示，相比于control細(xì)胞，PC9細(xì)胞和HCC827細(xì)胞中CA916798的mRNA均顯著上調(diào)（圖3-2C），Westernblot檢測(cè)顯示過表達(dá)細(xì)胞中CA916798蛋白的表達(dá)水平顯著增加（圖3-2D），此過表達(dá)細(xì)胞命名為OE-CA916798（簡(jiǎn)寫為OE-CA），用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們成功建立了穩(wěn)定敲低CA916798的肺癌耐藥細(xì)胞株及穩(wěn)定過表達(dá)CA916798肺癌敏感細(xì)胞株。圖3-2mRNA及蛋白水平檢測(cè)在NSCLC細(xì)胞中敲低和過表達(dá)CA916798的效率（A)qRT-PCR從mRNA水平檢測(cè)在EGFR-TKIs獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞株中敲低CA916798的效率。（B)WesternBlot在蛋白水平檢測(cè)在EGFR-TKIs獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞株中敲低CA916798的效率。（C）qRT-PCR從mRNA水平檢測(cè)在EGFR-TKIs敏感NSCLC細(xì)胞株中過表達(dá)CA916798的效率。（D）WesternBlot從蛋白水平實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在EGFR-TKIs敏感NSCLC細(xì)胞株中過表達(dá)CA916798的效率。3.3.3敲低CA916798可提高NSCLC耐藥細(xì)胞株對(duì)EGFR-TKIs的敏感性為了驗(yàn)證CA916798對(duì)細(xì)胞耐藥性的影響，我們采用CCK-8法檢測(cè)敲低

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文26CA916798后細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs藥物的半抑制濃度（IC50）的變化。結(jié)果顯示，在PC9/GR細(xì)胞中敲低CA196798后，PC9/GR對(duì)吉非替尼的IC50顯著降低，由10.34μM降至3.92μM（p<0.01）（圖3-3A）。同樣在HCC827/IR細(xì)胞中敲低CA916798后，HCC827/IR對(duì)埃克替尼的IC50也顯著降低，由13.34μM降至8.07μM（p<0.05)（圖3-3B）。以上結(jié)果說明，敲低CA916798可顯著降低耐藥NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的IC50，提高NSCLC耐藥細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs藥物的敏感性。圖3-3敲低CA916798提高NSCLC耐藥株對(duì)EGFR-TKIs敏感性（A）CCK-8法檢測(cè)在吉非替尼耐藥株P(guān)C9/GR中敲低CA916798后細(xì)胞對(duì)吉非替尼IC50的變化，與對(duì)照細(xì)胞相比較，敲低CA916798后IC50顯著降低（**，p<0.01)。（B）CCK-8法檢測(cè)在�？颂婺崮退幹闔CC827/IR中敲低CA916798后細(xì)胞對(duì)�？颂婺酙C50的變化，與對(duì)照細(xì)胞相比較，敲低CA916798導(dǎo)致IC50顯著降低（*，p<0.05)。3.3.4過表達(dá)CA916798可降低NSCLC耐藥細(xì)胞株對(duì)EGFR-TKIs的敏感性我們?cè)贓GFR-TKIs敏感細(xì)胞中過表達(dá)CA916798，并采用CCK-8法檢測(cè)過表達(dá)CA916798對(duì)EGFR-TKIsIC50的影響，與對(duì)照細(xì)胞相比較，過表達(dá)CA916798引起PC9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50顯著上升，由0.48μM提高至2.60μM（（p<0.001）（圖3-4A）；而在另一株細(xì)胞HCC827細(xì)胞中過表達(dá)CA916798后，也使該細(xì)胞對(duì)埃克替尼的IC50顯著提高，由0.06μM提高至1.42μM（p<0.001）（圖3-4B）。以上結(jié)果說明過表達(dá)CA916798可顯著提高敏感細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的IC50，降低敏感細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs藥物的敏感性。


本文編號(hào)：3002308