目的:運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選膀胱癌T24細(xì)胞適配子,為后續(xù)膀胱癌早期診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。方法:在體外人工合成兩端各有18bp的固定序列,中間含有52bp的隨機(jī)序列的單鏈寡核苷酸文庫,通過對PCR反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化與改良,運(yùn)用SELEX技術(shù)對膀胱癌細(xì)胞適配子進(jìn)行反復(fù)多輪次的篩選,并用流式細(xì)胞技術(shù)對得到的不同篩選輪次的適配子親和力進(jìn)行測定,將最后一輪篩選得到的產(chǎn)物進(jìn)行克隆,后交由測序公司進(jìn)行測序,并用軟件對得到的適配子序列的一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果:1、PCR反應(yīng)目的產(chǎn)物的量及純度很大程度上受不同的退火溫度及循環(huán)次數(shù)的影響,本實(shí)驗(yàn)中對稱PCR反應(yīng)的最佳退火溫度為62℃,最佳循環(huán)次數(shù)為25次;2、經(jīng)過10輪SELEX篩選,獲得的ss DNA文庫與膀胱癌T24細(xì)胞的親和力逐漸上升,表明不同輪次篩選后獲得的目的適配子逐步得到了富集。結(jié)論:成功建立了運(yùn)用SELEX技術(shù)體外篩選膀胱癌T24細(xì)胞高親和力和特異性的適配子的方法,并得到了親和力較高的適配子。 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
綜述
第1章 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 隨機(jī)寡核苷酸文庫及上下游引物
        1.1.2 細(xì)胞株及菌株
        1.1.3 試劑及工具酶
        1.1.4 主要儀器
        1.1.5 常用試劑配制
    1.2 方法
        1.2.1 膀胱癌T24的復(fù)蘇、換液、傳代及凍存
        1.2.2 PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化
        1.2.3 膀胱癌T24單細(xì)胞懸液的制備
        1.2.4 直接不對稱PCR法及超濾離心法制備初級篩選文庫
        1.2.5 次級文庫的制備與篩選
        1.2.6 正常人尿路上皮細(xì)胞的反篩
        1.2.7 運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同篩選輪次ssDNA的親和力
        1.2.8 目的片段的回收及純化
        1.2.9 目的DNA的克隆與測序
        1.2.10 適配子二級結(jié)構(gòu)分析
第2章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    2.1 膀胱癌細(xì)胞的培養(yǎng)
    2.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.2.1 普通對稱PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果
        2.2.2 不對稱PCR反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果
    2.3 運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)對不同篩選輪次ssDNA的親和力檢測結(jié)果
    2.4 目的 DNA 的純化及回收結(jié)果
    2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化結(jié)果
    2.6 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
    2.7 重組質(zhì)粒的PCR反應(yīng)鑒定
    2.8 目的DNA片段的測序
    2.9 適配子二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測
第3章 討論
第4章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]中國膀胱癌發(fā)病現(xiàn)狀及流行趨勢分析[J]. 韓蘇軍,張思維,陳萬青,李長嶺.  癌癥進(jìn)展. 2013(01)
[2]隨機(jī)單鏈DNA文庫SELEX篩選寡核苷酸適配子方法的建立[J]. 詹林盛,邵寧生,彭劍淳,孫紅琰,王全立.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2003(01)



本文編號：2977497