目的構建胰腺十二指腸同源框蛋白1（PDX1）基因真核表達載體并轉(zhuǎn)染至PANC-1細胞,觀察其對PI3K/AKT信號通路的影響。方法從Hela細胞中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)后PCR擴增PDX1編碼區(qū)片段,然后將PDX1的CDS插入PCMV6-Entry質(zhì)粒構建PCMV6-Entry-PDX1表達重組體。重組體轉(zhuǎn)染至PANC-1細胞中通過G418篩選出穩(wěn)定表達細胞株。Western blot分析PDX1蛋白水平表達及p-AKT水平變化。結果 PDX1基因成功在PANC-1中表達。利用Western blot檢測驗證獲得了穩(wěn)定的PDX1過表達細胞株。Western blot結果顯示:過表達PDX1的細胞株AKT表達含量與正常細胞及對照細胞沒有區(qū)別而p-AKT水平降低。結論PDX1基因過表達能夠降低PANC-1細胞的p-AKT水平。 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學學報. 2017,52(02)北大核心

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【部分圖文】：

PDX1基因的擴增及重組質(zhì)粒構建與鑒定A:PDX1基因PCＲ擴增圖;B:PDX1重組質(zhì)粒酶切鑒定圖;C:PDX1重組質(zhì)粒部分測序結果;M:DNAMarker;1:PDX1基因全長PCＲ產(chǎn)

圖1PDX1基因的擴增及重組質(zhì)粒構建與鑒定A:PDX1基因PCＲ擴增圖;B:PDX1重組質(zhì)粒酶切鑒定圖;C:PDX1重組質(zhì)粒部分測序結果;M:DNAMarker;1:PDX1基因全長PCＲ產(chǎn)物;2:雙酶切PCMV6-Entry質(zhì)粒;3:雙酶切PDX1重組質(zhì)粒圖2Westernblot法分析PDX1、AKT及pAKT結果1:未轉(zhuǎn)染組;2:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組;3:過表達組;與未轉(zhuǎn)染組比較:*P＜0.05;與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較:#P＜0.053討論在胰腺發(fā)育過程中，PDX1決定胚胎內(nèi)胚層向胰腺祖細胞發(fā)展的機制，目前還不是很清楚。由于其在胰腺中的關鍵作用，許多研究試圖利用PDX1將相應的組織和細胞重編程為胰腺細胞系。研究［9－10］表明在人皮膚角質(zhì)化細胞和人肝臟細胞中過表達PDX1細胞轉(zhuǎn)變成胰腺β細胞并分泌胰島素。PDX1是胰腺發(fā)育中的關鍵性調(diào)節(jié)分子，控制胰腺細胞的生長和分化，而胰腺癌細胞的顯著特點是低分化。因此，在胰腺癌細胞中PDX1表達缺失可能在發(fā)病中起一定作用，本研究顯示過表達PDX1下調(diào)p-AKT水平。PI3K-AKT信號通路是細胞生存信號轉(zhuǎn)導下游的共有途徑，該途徑激活進而導致細胞增殖，抑制細胞凋亡［11－12］。AKT是一個非常重要的信號中心，其能與100多種下游物質(zhì)結合進而發(fā)生作用，例如:能夠與糖原合成酶激酶-3(GSK-3)結合促進葡萄糖的攝取及合成糖原來儲存能量［13］。該途徑具有很重要的生理學功能，在癌癥中該途徑活性上調(diào)。因此，PDX1過表達可能調(diào)控胰腺癌細胞的生物學行為，但其機制有待進一步研究。·188·安徽醫(yī)科大學學報ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2017Feb;52(2)

圖1PDX1基因的擴增及重組質(zhì)粒構建與鑒定A:PDX1基因PCＲ擴增圖;B:PDX1重組質(zhì)粒酶切鑒定圖;C:PDX1重組質(zhì)粒部分測序結果;M:DNAMarker;1:PDX1基因全長PCＲ產(chǎn)物;2:雙酶切PCMV6-Entry質(zhì)粒;3:雙酶切PDX1重組質(zhì)粒圖2Westernblot法分析PDX1、AKT及pAKT結果1:未轉(zhuǎn)染組;2:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組;3:過表達組;與未轉(zhuǎn)染組比較:*P＜0.05;與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較:#P＜0.053討論在胰腺發(fā)育過程中，PDX1決定胚胎內(nèi)胚層向胰腺祖細胞發(fā)展的機制，目前還不是很清楚。由于其在胰腺中的關鍵作用，許多研究試圖利用PDX1將相應的組織和細胞重編程為胰腺細胞系。研究［9－10］表明在人皮膚角質(zhì)化細胞和人肝臟細胞中過表達PDX1細胞轉(zhuǎn)變成胰腺β細胞并分泌胰島素。PDX1是胰腺發(fā)育中的關鍵性調(diào)節(jié)分子，控制胰腺細胞的生長和分化，而胰腺癌細胞的顯著特點是低分化。因此，在胰腺癌細胞中PDX1表達缺失可能在發(fā)病中起一定作用，本研究顯示過表達PDX1下調(diào)p-AKT水平。PI3K-AKT信號通路是細胞生存信號轉(zhuǎn)導下游的共有途徑，該途徑激活進而導致細胞增殖，抑制細胞凋亡［11－12］。AKT是一個非常重要的信號中心，其能與100多種下游物質(zhì)結合進而發(fā)生作用，例如:能夠與糖原合成酶激酶-3(GSK-3)結合促進葡萄糖的攝取及合成糖原來儲存能量［13］。該途徑具有很重要的生理學功能，在癌癥中該途徑活性上調(diào)。因此，PDX1過表達可能調(diào)控胰腺癌細胞的生物學行為，但其機制有待進一步研究。·188·安徽醫(yī)科大學學報ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2017Feb;52(2)


本文編號：2972087