發(fā)布時(shí)間：2021-01-12 03:48

　　目的構(gòu)建胰腺十二指腸同源框蛋白1（PDX1）基因真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至PANC-1細(xì)胞,觀察其對PI3K/AKT信號通路的影響。方法從Hela細(xì)胞中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)后PCR擴(kuò)增PDX1編碼區(qū)片段,然后將PDX1的CDS插入PCMV6-Entry質(zhì)粒構(gòu)建PCMV6-Entry-PDX1表達(dá)重組體。重組體轉(zhuǎn)染至PANC-1細(xì)胞中通過G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。Western blot分析PDX1蛋白水平表達(dá)及p-AKT水平變化。結(jié)果 PDX1基因成功在PANC-1中表達(dá)。利用Western blot檢測驗(yàn)證獲得了穩(wěn)定的PDX1過表達(dá)細(xì)胞株。Western blot結(jié)果顯示:過表達(dá)PDX1的細(xì)胞株AKT表達(dá)含量與正常細(xì)胞及對照細(xì)胞沒有區(qū)別而p-AKT水平降低。結(jié)論P(yáng)DX1基因過表達(dá)能夠降低PANC-1細(xì)胞的p-AKT水平。 

【文章來源】：安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2017,52(02)北大核心

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

PDX1基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定A:PDX1基因PCＲ擴(kuò)增圖;B:PDX1重組質(zhì)粒酶切鑒定圖;C:PDX1重組質(zhì)粒部分測序結(jié)果;M:DNAMarker;1:PDX1基因全長PCＲ產(chǎn)

圖1PDX1基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定A:PDX1基因PCＲ擴(kuò)增圖;B:PDX1重組質(zhì)粒酶切鑒定圖;C:PDX1重組質(zhì)粒部分測序結(jié)果;M:DNAMarker;1:PDX1基因全長PCＲ產(chǎn)物;2:雙酶切PCMV6-Entry質(zhì)粒;3:雙酶切PDX1重組質(zhì)粒圖2Westernblot法分析PDX1、AKT及pAKT結(jié)果1:未轉(zhuǎn)染組;2:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組;3:過表達(dá)組;與未轉(zhuǎn)染組比較:*P＜0.05;與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較:#P＜0.053討論在胰腺發(fā)育過程中，PDX1決定胚胎內(nèi)胚層向胰腺祖細(xì)胞發(fā)展的機(jī)制，目前還不是很清楚。由于其在胰腺中的關(guān)鍵作用，許多研究試圖利用PDX1將相應(yīng)的組織和細(xì)胞重編程為胰腺細(xì)胞系。研究［9－10］表明在人皮膚角質(zhì)化細(xì)胞和人肝臟細(xì)胞中過表達(dá)PDX1細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胰腺β細(xì)胞并分泌胰島素。PDX1是胰腺發(fā)育中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)分子，控制胰腺細(xì)胞的生長和分化，而胰腺癌細(xì)胞的顯著特點(diǎn)是低分化。因此，在胰腺癌細(xì)胞中PDX1表達(dá)缺失可能在發(fā)病中起一定作用，本研究顯示過表達(dá)PDX1下調(diào)p-AKT水平。PI3K-AKT信號通路是細(xì)胞生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的共有途徑，該途徑激活進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［11－12］。AKT是一個(gè)非常重要的信號中心，其能與100多種下游物質(zhì)結(jié)合進(jìn)而發(fā)生作用，例如:能夠與糖原合成酶激酶-3(GSK-3)結(jié)合促進(jìn)葡萄糖的攝取及合成糖原來儲(chǔ)存能量［13］。該途徑具有很重要的生理學(xué)功能，在癌癥中該途徑活性上調(diào)。因此，PDX1過表達(dá)可能調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。·188·安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2017Feb;52(2)

圖1PDX1基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定A:PDX1基因PCＲ擴(kuò)增圖;B:PDX1重組質(zhì)粒酶切鑒定圖;C:PDX1重組質(zhì)粒部分測序結(jié)果;M:DNAMarker;1:PDX1基因全長PCＲ產(chǎn)物;2:雙酶切PCMV6-Entry質(zhì)粒;3:雙酶切PDX1重組質(zhì)粒圖2Westernblot法分析PDX1、AKT及pAKT結(jié)果1:未轉(zhuǎn)染組;2:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組;3:過表達(dá)組;與未轉(zhuǎn)染組比較:*P＜0.05;與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較:#P＜0.053討論在胰腺發(fā)育過程中，PDX1決定胚胎內(nèi)胚層向胰腺祖細(xì)胞發(fā)展的機(jī)制，目前還不是很清楚。由于其在胰腺中的關(guān)鍵作用，許多研究試圖利用PDX1將相應(yīng)的組織和細(xì)胞重編程為胰腺細(xì)胞系。研究［9－10］表明在人皮膚角質(zhì)化細(xì)胞和人肝臟細(xì)胞中過表達(dá)PDX1細(xì)胞轉(zhuǎn)變成胰腺β細(xì)胞并分泌胰島素。PDX1是胰腺發(fā)育中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)分子，控制胰腺細(xì)胞的生長和分化，而胰腺癌細(xì)胞的顯著特點(diǎn)是低分化。因此，在胰腺癌細(xì)胞中PDX1表達(dá)缺失可能在發(fā)病中起一定作用，本研究顯示過表達(dá)PDX1下調(diào)p-AKT水平。PI3K-AKT信號通路是細(xì)胞生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的共有途徑，該途徑激活進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡［11－12］。AKT是一個(gè)非常重要的信號中心，其能與100多種下游物質(zhì)結(jié)合進(jìn)而發(fā)生作用，例如:能夠與糖原合成酶激酶-3(GSK-3)結(jié)合促進(jìn)葡萄糖的攝取及合成糖原來儲(chǔ)存能量［13］。該途徑具有很重要的生理學(xué)功能，在癌癥中該途徑活性上調(diào)。因此，PDX1過表達(dá)可能調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。·188·安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)ActaUniversitatisMedicinalisAnhui2017Feb;52(2)


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