實(shí)驗(yàn)?zāi)康腟IN3A是轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體SIN3A/HDAC的核心組分,通過其組蛋白去乙�；富钚越档图�(xì)胞內(nèi)組蛋白乙�；綇亩{(diào)控基因的表達(dá),參與到許多生物學(xué)過程中,例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、分化、哺乳動物發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等。但是SIN3A/HDAC復(fù)合體在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的生物學(xué)功能仍不夠明確,為了進(jìn)一步探究其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用蛋白及機(jī)制,我們進(jìn)行了以下研究。實(shí)驗(yàn)方法1.在乳腺癌MCF-7細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)FLAG-SIN3A的質(zhì)粒,通過免疫親和純化和銀染質(zhì)譜測序分析鑒定SIN3A的體內(nèi)相互作用蛋白,并用蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫共沉淀和快速蛋白液相色譜對上述的蛋白之間相互作用進(jìn)行驗(yàn)證。采用GST pull-down實(shí)驗(yàn)探究直接相互作用蛋白的機(jī)制,并利用體外酶活性實(shí)驗(yàn)分析復(fù)合體的酶活性。2.在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中利用Ch IP-on-chip在全基因組范圍內(nèi)尋找出LSD1/SIN3A/HDAC復(fù)合體可能的共同調(diào)控的下游靶基因,通過KEGG對這些靶基因進(jìn)行通路分析,并使用Ch IP-PCR和q Ch IP實(shí)驗(yàn)對Ch IP-on-chip結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。3.采用細(xì)胞生長曲線、平板克隆... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

SIN3A結(jié)合蛋白的免疫親和純化分析

一、LSD1 與 SIN3A/HDAC 復(fù)津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 合體具有體內(nèi)直接相互作用為了進(jìn)一步證實(shí)LSD1和SIN3A/HDAC復(fù)合體在體內(nèi)存在相互作用，我們采快速液相色譜（FPLC）實(shí)驗(yàn)，首先提取MCF-7細(xì)胞的全核蛋白，濃縮并用BS置換溶液介質(zhì)，隨后將蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠過濾預(yù)裝柱 Superose 6進(jìn)行分離，收流出組分，進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果如圖1.2所示，LSD1和IN3A/HDAC復(fù)合體核心組分SIN3A, HDAC1, HDAC2, RbAp46/48, SAP 180,AP130, and SAP30的主峰都出現(xiàn)在669-2000kDa之間，且流出峰相似有很大程的重合，這提示LSD1和SIN3A/HDAC復(fù)合體在體內(nèi)存在相互作用，它們?nèi)咭粋€(gè)有機(jī)整體。

一、LSD1 與 S士學(xué)位論文 合體具有體內(nèi)，再用 LSD1 抗體進(jìn)行免疫印跡檢測，也顯示出同樣癌 T-47D 細(xì)胞系的全細(xì)胞裂解液重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，進(jìn)時(shí)也得到了與 MCF-7 細(xì)胞系中一致的結(jié)果（圖 1.3驗(yàn)結(jié)果都有力地證明了 LSD1 在體內(nèi)與 SIN3A/HDA于 SIN3A/HDAC 復(fù)合體的成分之一。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]端粒酶催化亞單位和c-Myc蛋白在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)及意義[J]. 張鳳英,劉敬波,苑鐵軍,劉清明,韓在文,王樹勇,張傳毅,陳淑萍.  臨床耳鼻咽喉科雜志. 2005(07)



本文編號：2967689