實驗?zāi)康腟IN3A是轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體SIN3A/HDAC的核心組分,通過其組蛋白去乙酰化酶活性降低細胞內(nèi)組蛋白乙�；綇亩{(diào)控基因的表達,參與到許多生物學(xué)過程中,例如細胞增殖、細胞凋亡、分化、哺乳動物發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等。但是SIN3A/HDAC復(fù)合體在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的生物學(xué)功能仍不夠明確,為了進一步探究其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用蛋白及機制,我們進行了以下研究。實驗方法1.在乳腺癌MCF-7細胞系中穩(wěn)定表達FLAG-SIN3A的質(zhì)粒,通過免疫親和純化和銀染質(zhì)譜測序分析鑒定SIN3A的體內(nèi)相互作用蛋白,并用蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫共沉淀和快速蛋白液相色譜對上述的蛋白之間相互作用進行驗證。采用GST pull-down實驗探究直接相互作用蛋白的機制,并利用體外酶活性實驗分析復(fù)合體的酶活性。2.在乳腺癌MCF-7細胞中利用Ch IP-on-chip在全基因組范圍內(nèi)尋找出LSD1/SIN3A/HDAC復(fù)合體可能的共同調(diào)控的下游靶基因,通過KEGG對這些靶基因進行通路分析,并使用Ch IP-PCR和q Ch IP實驗對Ch IP-on-chip結(jié)果進行驗證。3.采用細胞生長曲線、平板克隆... 

【文章來源】：天津醫(yī)科大學(xué)天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：132 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

SIN3A結(jié)合蛋白的免疫親和純化分析

一、LSD1 與 SIN3A/HDAC 復(fù)津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文 合體具有體內(nèi)直接相互作用為了進一步證實LSD1和SIN3A/HDAC復(fù)合體在體內(nèi)存在相互作用，我們采快速液相色譜（FPLC）實驗，首先提取MCF-7細胞的全核蛋白，濃縮并用BS置換溶液介質(zhì)，隨后將蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠過濾預(yù)裝柱 Superose 6進行分離，收流出組分，進行Western blotting檢測，結(jié)果如圖1.2所示，LSD1和IN3A/HDAC復(fù)合體核心組分SIN3A, HDAC1, HDAC2, RbAp46/48, SAP 180,AP130, and SAP30的主峰都出現(xiàn)在669-2000kDa之間，且流出峰相似有很大程的重合，這提示LSD1和SIN3A/HDAC復(fù)合體在體內(nèi)存在相互作用，它們?nèi)咭粋�有機整體。

一、LSD1 與 S士學(xué)位論文 合體具有體內(nèi)，再用 LSD1 抗體進行免疫印跡檢測，也顯示出同樣癌 T-47D 細胞系的全細胞裂解液重復(fù)以上實驗，進時也得到了與 MCF-7 細胞系中一致的結(jié)果（圖 1.3驗結(jié)果都有力地證明了 LSD1 在體內(nèi)與 SIN3A/HDA于 SIN3A/HDAC 復(fù)合體的成分之一。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]端粒酶催化亞單位和c-Myc蛋白在中耳膽脂瘤上皮中的表達及意義[J]. 張鳳英,劉敬波,苑鐵軍,劉清明,韓在文,王樹勇,張傳毅,陳淑萍.  臨床耳鼻咽喉科雜志. 2005(07)



本文編號：2967689