癌癥作為全球主要的公共健康問題,已經(jīng)成為第二大致死性疾病。而癌癥的高發(fā)生、高致死率與癌細(xì)胞的增殖分化異常及浸潤轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。大量研究表明,糖基化修飾異常會(huì)改變細(xì)胞的生物學(xué)特征。已有報(bào)道證實(shí)糖基轉(zhuǎn)移酶IVa(GnT-IVa)和糖基轉(zhuǎn)移酶V(GnT-V)的表達(dá)異常都能夠影響癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化(EMT),GnT-V過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤的生長。但關(guān)于GnT-IVa能夠調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生及細(xì)胞分化的報(bào)道較少。在課題組前期的研究工作中,我們發(fā)現(xiàn)幾種常見的癌癥,比如肝癌,絨毛膜癌及宮頸癌中GnT-IVa在癌組織中的表達(dá)量比癌旁組織高,且初步的裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)GnT-IVa的確可以促進(jìn)腫瘤的形成。因此,為了初步探索GnT-IVa對癌細(xì)胞增殖影響的機(jī)制,我們主要利用MTT、克隆形成、流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR、Western Blot、co-IP及LC-MS/MS等技術(shù)手段對細(xì)胞增殖形態(tài)、細(xì)胞周期分布及相關(guān)信號分子的改變?nèi)齻�(gè)方面進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)中,我們選取了實(shí)驗(yàn)室已有的細(xì)胞系模型:內(nèi)源低表達(dá)GnT-IVa的AV3細(xì)胞及其GnT-IVa穩(wěn)轉(zhuǎn)株AV3/GnT-IVa和內(nèi)源高表達(dá)GnT-IVa的HepG2細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,將GnT-IVa過表達(dá)后,AV3細(xì)胞的增殖能力明顯提高。利用靶向GnT-IVa的siRNA對過表達(dá)或高表達(dá)GnT-IVa的細(xì)胞系進(jìn)行干擾沉默,細(xì)胞的增殖能力下降,且增殖相關(guān)分子Ki67的mRNA表達(dá)下調(diào)。這初步說明GnT-IVa能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。進(jìn)而我們利用流式細(xì)胞儀檢測了AV3,AV3/GnT-IVa,AV3/si-NC,AV3/si-GnT-IVa,HepG2,HepG2/si-NC和HepG2/si-GnT-IVa這幾種細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞周期。初步發(fā)現(xiàn)GnT-IVa是通過促進(jìn)癌細(xì)胞G1/S期的進(jìn)程來提高增殖能力,而對凋亡沒有明顯的影響。隨后利用實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)分別檢測了周期相關(guān)分子CyclinD1和CyclinD2,發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶IVa能夠促進(jìn)這兩種周期蛋白的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步探明GnT-IVa參與調(diào)控細(xì)胞周期的中間分子,我們借助LC-MS/MS對凝集素DSL免疫沉淀下來的AV3,AV3/GnT-IVa和AV3/si-GnT-IVa蛋白樣品進(jìn)行定性分析,發(fā)現(xiàn)含有N-糖鏈的膜蛋白Integrinβ1存在變化。利用qRT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Integrinβ1的表達(dá)受GnT-IVa正向調(diào)控。利用已有的抗體對Integrinβ1免疫沉淀后進(jìn)行凝集素Blot,發(fā)現(xiàn)Integrinβ1的β1,4糖鏈也明顯增多。另外,利用靶向Integrinβ1的siRNA在AV3/GnT-IVa和HepG2中進(jìn)行沉默干擾后,流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示G1/S期受到阻滯。我們進(jìn)一步利用qRT-PCR,Western Blot分析了Integrinβ1/FAK增殖通路中的幾個(gè)關(guān)鍵信號分子p-ERK和c-Myc的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)分子均與GnT-IVa表達(dá)成正相關(guān)。因此,我們初步得出結(jié)論GnT-IVa可能通過糖基化Integrinβ1,從而調(diào)控了Integrinβ1參與的細(xì)胞增殖通路。綜上所得,GnT-IVa能夠通過加快癌細(xì)胞增殖促進(jìn)腫瘤的形成。它可能通過糖基化細(xì)胞膜蛋白Integrinβ1,刺激下游信號分子,導(dǎo)致FAK,P-ERK和c-Myc表達(dá)升高,從而促進(jìn)了G1/S特異性周期蛋白cyclinD1和cyclinD2的表達(dá)成熟,進(jìn)而加快了癌細(xì)胞的增殖。本研究為闡明糖基化修飾對細(xì)胞增殖的影響奠定了基礎(chǔ),也為GnT-IVa的深入研究開辟了新思路。
【學(xué)位單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R73-3
【部分圖文】：

圖 1-1 生長因子信號調(diào)節(jié)細(xì)胞外營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝幾十年中，針對不同類型的增殖細(xì)胞的研究出現(xiàn)中的代謝與靜息細(xì)胞中的新陳代謝不同的是其糖他大分子的生物合成速率很高（圖 1-2）。Ralph 代謝活動(dòng)的作用以及在增殖過程中補(bǔ)充三羧酸（rosis）。他們還討論了關(guān)于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如何影響營養(yǎng)物質(zhì)，能量和生物合成的活性可以保證每次子組分。 因此，增殖細(xì)胞中的代謝活性與非增殖

圖 1-1 生長因子信號調(diào)節(jié)細(xì)胞外營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝[17]幾十年中，針對不同類型的增殖細(xì)胞的研究出現(xiàn)一致的中的代謝與靜息細(xì)胞中的新陳代謝不同的是其糖酵解，他大分子的生物合成速率很高（圖 1-2）。Ralph J.DeBe代謝活動(dòng)的作用以及在增殖過程中補(bǔ)充三羧酸（TCA）rosis）。他們還討論了關(guān)于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如何影響細(xì)胞代營養(yǎng)物質(zhì)，能量和生物合成的活性可以保證每次通過細(xì)子組分。 因此，增殖細(xì)胞中的代謝活性與非增殖細(xì)胞中過考察幾種核心通量，包括有氧糖酵解，脂質(zhì)生物合成性，形成支持不同細(xì)胞類型增殖的固有平臺。 他們還假過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的細(xì)胞介質(zhì)（包括磷脂酰肌醇 3- 系統(tǒng)，缺氧誘導(dǎo)因子 1（HIF-1）和 Myc）調(diào)節(jié)這些通量和

哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文管疾病的病因?qū)W中起關(guān)鍵作用。蛋白聚糖可能是生物學(xué)中最復(fù)雜和分子，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)展已經(jīng)開始加速[39]。幾乎所有感染人類毒都通過與特定細(xì)胞表面聚糖識別而與細(xì)胞結(jié)合。糖組學(xué)和聚糖陣傳染病的診斷和預(yù)研究產(chǎn)生重大影響。床癌癥診斷標(biāo)記通常是糖蛋白，但大多數(shù)目前的診斷測試僅測量多然，鑒于與癌癥相關(guān)的聚糖長期已知的改變，檢測蛋白質(zhì)的特定糖物極有可能對癌癥的早期檢測具有更高的靈敏度和特異性[40]。因此蛋白組學(xué)的趨同發(fā)現(xiàn)是用于癌癥早期檢測的生物標(biāo)志物的關(guān)鍵[41]。品和藥物管理局批準(zhǔn)講巖藻糖基化的甲胎蛋白作為原發(fā)性肝癌的診外，巖藻糖基化的觸珠蛋白相比簡單監(jiān)測觸珠蛋白多肽的表達(dá)能夠腺癌標(biāo)志物。用以鑒定人類疾病的生物標(biāo)志物的系統(tǒng)生物學(xué)分析 gly用與基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)相同的方法（圖 1
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本文編號：2867004