目的據(jù)2017年中國腫瘤登記年報(bào)顯示全國每天約1萬人確診為癌癥,每分鐘約7人確診患癌。死亡率排前的癌癥主要是肺癌和消化系統(tǒng)癌癥。食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一,顯著的地域性分布差異是其流行病學(xué)的突出特征。中國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家,又以食管鱗癌最為常見。河南省是中國食管鱗癌的高發(fā)地區(qū),發(fā)病率高,死亡率高,嚴(yán)重威脅著人民的生命健康。食管鱗癌的相關(guān)問題厄待解決!食管鱗癌的發(fā)病原因多種多樣,它的發(fā)生機(jī)制也是錯(cuò)綜復(fù)雜,有許多研究發(fā)現(xiàn)它與多種信號(hào)通路的激活有關(guān),但其具體的發(fā)生發(fā)展機(jī)制現(xiàn)在尚不清楚。眾所周知人體的生命活動(dòng)需要眾多信號(hào)通路的參與來共同調(diào)控細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、骨架重排等。據(jù)多篇研究顯示,Paks位于這些信號(hào)通路的結(jié)點(diǎn)處,具有多重生物學(xué)作用。Paks是p21激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,能夠被小G蛋白R(shí)ho家族中的Rac1和Cdc42所激活,具有六個(gè)家族成員。在這六個(gè)家庭成員中,Pak1和Pak4是研究最多的。據(jù)多篇研究顯示,Pak1和Pak4在許多腫瘤組織中均是高達(dá)的,并且Pak4是Paks中與人類腫瘤關(guān)系最為密切的成員,在已檢測過的100多種人類腫瘤細(xì)胞中,有多達(dá)78%的細(xì)胞高表達(dá)Pak4。人類pak4基因定位于染色體19q13.2,長度為3064bp,一共編碼591個(gè)氨基酸,其相對分子質(zhì)量為72000Da。和其他家族成員不同的是,Pak4在胚胎和成體組織中廣泛表達(dá)。它可以通過自身磷酸化、被外源性蛋白激酶磷酸化、甲基化等方式被活化。研究顯示,Pak4可參與Pak4/MEK/ERK、Pak4/PI3K/AKT/m TOR、Pak4/LIMK1/confilin等多條信號(hào)通路,從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。多項(xiàng)研究顯示,Pak4在乳腺癌、肝癌、膀胱癌、前列腺癌等多種癌癥中均起到重要調(diào)控作用,但是Pak4在食管鱗癌中的作用及其作用機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。本研究將通過采用人食管鱗癌組織芯片以及不同種類的人食管鱗癌細(xì)胞株,研究Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá);通過小RNA干擾實(shí)驗(yàn)和c DNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),研究Pak4對食管鱗癌細(xì)胞增殖,遷移和侵襲的影響;通過體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確Pak4在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用,并用western blotting探討Pak4在食管鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲中的作用機(jī)制,為Pak4作為臨床食管鱗癌患者治療的新靶標(biāo)提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。第一部分:探討Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)方法1.利用免疫組織化學(xué)的方法檢測Pak4以及p-Pak4(S474)在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況。2.利用western blotting來檢測正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞株中Pak4以及p-Pak4(S474)的表達(dá)情況。結(jié)果與正常食管組織和食管上皮細(xì)胞相比,Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和大多數(shù)食管鱗癌細(xì)胞中均是高表達(dá)的。第二部分:探討Pak4表達(dá)降低對食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響方法1.構(gòu)建七個(gè)包含不同pak4 sh RNA序列的PLKO.1載體。2.利用病毒感染的方法,敲低Pak4表達(dá)量相對較高的ECA109和Kyse450兩種食管鱗癌細(xì)胞株中Pak4的表達(dá),利用western blotting鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)株中Pak4的敲低效率。3.利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來探討Pak4表達(dá)降低后,食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的變化。4.利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)來研究Pak4表達(dá)降低后,食管鱗癌細(xì)胞克隆形成能力的變化。5.利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來探討Pak4表達(dá)降低后,食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的變化。6.利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來證明Pak4表達(dá)降低后,食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果Pak4參與食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程,Pak4表達(dá)降低會(huì)抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和侵襲能力。第三部分:探討Pak4表達(dá)升高對食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響方法1.利用轉(zhuǎn)染的方法把pak4的c DNA轉(zhuǎn)染進(jìn)Pak4表達(dá)量相對較低的Kyse30和Kyse150兩種食管鱗癌細(xì)胞株中,再次利用western blotting鑒定Pak4過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株是否建立成功。2.利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來探討Pak4表達(dá)增加后,食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的變化。3.利用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)來研究Pak4表達(dá)增加后,食管鱗癌細(xì)胞克隆形成能力的變化。4.利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來探討Pak4表達(dá)增加后,食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的變化。5.利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來證明Pak4表達(dá)增加后,食管鱗癌細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果Pak4表達(dá)增加,食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和侵襲能力均增高,Pak4參與食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。第四部分:用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Pak4在食管鱗癌中的作用方法根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇ECA109-shmock、ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2三種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn),觀察Pak4降低后,裸鼠瘤重和瘤體積的變化。結(jié)果ECA109-shmock的成瘤時(shí)間為4天,ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2的成瘤時(shí)間分別為9天和6天;與ECA109-shmock相比,ECA109-shpak4-1和ECA109-shpak4-2的瘤重小,瘤體積也小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。第五部分:探討Pak4影響食管鱗癌增殖和侵襲的作用機(jī)制方法用western blotting實(shí)驗(yàn)來初步探討Pak4影響食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用機(jī)制。結(jié)果Pak4通過參與ERK,AKT和EMT信號(hào)通路影響食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。結(jié)論1.相比較正常食管組織和正常食管上皮細(xì)胞,Pak4和p-Pak4在食管鱗癌組織和食管鱗癌細(xì)胞中均是高表達(dá)的。2.Pak4促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,其作用可能是通過ERK、AKT和EMT信號(hào)通路的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.1
【部分圖文】：

17圖 1.1 Pak4 及 p-Pak4 在食管組織中的表達(dá)情況及結(jié)果分析比例尺為 50μm，*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。2 Pak4 以及 p-Pak4 在食管鱗癌細(xì)胞株中是高表達(dá)的將收集的細(xì)胞從-80℃冰箱中取出冰上溶解，加入適量裂解液提取蛋 Western blotting 驗(yàn)證不同來源的食管鱗癌細(xì)胞株中 Pak4 及 p-Pak4 的表達(dá)

Westernblotting檢測不同來源的食管鱗癌細(xì)胞株中Pak4及p-Pak4（S474）的表

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 PLKO.1-shpak4 載體的構(gòu)建選用 PLKO.1 作為載體，在載體上連接 pak4 的 shRNA 序列，連接成功后對構(gòu)建的載體進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定。結(jié)果如圖 2.1 所示，7 個(gè)序列在酶切之后均出現(xiàn)了 2kb 和 5kb 兩個(gè)片段，說明 shRNA 序列連接的位置是正確的。測序結(jié)果（僅呈現(xiàn)其中兩個(gè)序列）顯示構(gòu)建的載體中包含著 pak4 的 shRNA 序列，說明連接的順序是正確的。由酶切鑒定和測序鑒定的結(jié)果可知，PLKO.1-shpak4 載體構(gòu)建成功。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 云揚(yáng);陳潔;陳飛飛;;Pak4的生物學(xué)特性及其與腫瘤的相關(guān)性研究[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2011年09期

2 ;Angiopoietin-1 targeted RNA interference suppresses angiogenesis and tumor growth of esophageal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2008年10期

本文編號(hào)：2824604