發(fā)布時間：2020-08-15 09:49

【摘要】：背景根據(jù)病理類型的不同,肝癌可分為肝細胞性肝癌、膽管細胞性肝癌和混合性肝癌,其中90%屬于肝細胞性肝癌~([1])。因此本研究主要討論是肝細胞性肝癌。肝癌因預(yù)后差,死亡率高,被稱為癌中之王~([2-3])。肝癌的發(fā)生發(fā)展具有起病隱匿、臨床癥狀、體征不典型及病情進展迅速等特點,從而導(dǎo)致其發(fā)病率和死亡率逐年升高~([4])。由于肝癌的存活率低,發(fā)病較為隱匿,多數(shù)肝癌確診已為中晚期,已失去有效治療的機會,因此肝癌的早期診斷就顯得十分重要。肝癌預(yù)后差,肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者療效和獲得長期生存的關(guān)鍵問題~([5])。目前,肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移機制尚不十分清楚,隨著對肝癌的深入研究,特別是分子生物學(xué)的進步,肝癌的基因治療逐漸成為臨床應(yīng)用中很具前景的靶向治療,尋找新的有效的治療手段成為國內(nèi)外研究的熱點之一~([6,7])。肝細胞肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多步驟的過程,其中降解細胞外細胞外屏障是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的始動步驟~([8,9])。微小RNA(MicroRNAs,miRNAS)是一類短小的,高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA,在真核生物中發(fā)現(xiàn)的可以實現(xiàn)調(diào)節(jié)功能,長度約21-25個核苷酸(nt)。MicroRNAs(miRNAS)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。大量的MicroRNAs(miRNAS)的靶基因是抑癌基因或癌基因,且多個MicroRNAs(miRNAS)分子被證實參與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)。微小RNA能夠識別特定目標mRNA或抑制蛋白翻譯,從而轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮負調(diào)控作用。超過一半的人類MicroRNAs(miRNAS)基因位于脆弱位點或包含有腫瘤腫瘤相關(guān)基因的區(qū)域,而且MicroRNAs(miRNAS)有著廣泛的生物學(xué)功能,包含了細胞的凋亡、增殖、代謝、分化及腫瘤的生長調(diào)控及形成過程等。MicroRNAs(miRNAS)沉默靶基因的主要分子生物學(xué)機制是通過MicroRNAs(miRNAS)保守的種子區(qū)域序列(約2-7個核苷酸(nt))特異的結(jié)合靶基因的3-UTR而實現(xiàn)的。RNA技術(shù)是近些年發(fā)展起來的基因沉默技術(shù),是利用雙鏈RNA特異性地降解具有同源序列的mRNA,從而沉默相應(yīng)基因的表達~([10-13])。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是細胞由上皮狀態(tài)向間質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)化的過程,它也是細胞轉(zhuǎn)移的重要特點。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化對于腫瘤的惡化發(fā)展都具有重要的影響,能夠顯著增強腫瘤細胞的侵襲能力。在EMT過程中,上皮功能的喪失以及間質(zhì)功能的獲得顯著增強了細胞的遷移和侵襲能力。E-cadherin是上皮細胞的特異分子標記物,Vimentin是間質(zhì)細胞的特異分子標記物,因此Vimentin蛋白的獲得以及E-cadherin蛋白的丟失表明細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化~([14-16])。SNAI1(snail)是一個與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,它能夠抑制E-cadherin表達并促進腫瘤的遷移和侵襲。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起到了關(guān)鍵作用,并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)~([17-19])。在多種腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中,都出現(xiàn)了SNAI1的異常表達。近年來越來越多的證據(jù)顯示,SNAI1在EMT的調(diào)節(jié)過程中具有十分重要的作用。此外SNAI1誘導(dǎo)的E-cadherin下調(diào)被證實在觸發(fā)腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中具有關(guān)鍵性作用~([20-21])。腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多階段的復(fù)雜的過程,包括在血液循環(huán)中的轉(zhuǎn)運,對周圍組織的浸潤及遠端轉(zhuǎn)移灶的形成等多個環(huán)節(jié),在以上過程中,肝癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認為是一個特征性事件~([22-24])。microRNA-100定位于人類染色體11q24.1,大小約為22個核苷酸,位于人染色體11q24.1,其種子序列區(qū)含有雙GC對,另一末端為TA,這一結(jié)構(gòu)特點決定其靶基因種類少,種子序列區(qū)結(jié)合力強~([25-27])。既往的研究表明,microRNA-100在不同的病變中呈現(xiàn)不同的表達方式。既往的研究發(fā)現(xiàn),在膀胱癌的細胞、組織中,microRNA-100的表達是下調(diào)的,體外過表達microRNA-100是能夠?qū)Π螂装┘毎那忠u和轉(zhuǎn)移起到抑制作用~([29-30])�，F(xiàn)已證實在多種腫瘤細胞中,miRNA-99a/100通過mTOR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)并改變細胞的增值遷移功能~([31-32])。我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)microRNA-100在正常的人肝細胞中高表達,而在肝細胞肝癌細胞株中低表達。隋承光的研究發(fā)現(xiàn),過表達的microRNA-100通過抑制mTOR的表達抑制肝癌的遷移和侵襲能力,主要通過上調(diào)上調(diào)E-cadherin的表達,阻斷了EMT的發(fā)生過程~([33])。近年來,microRNA-100在肝癌的發(fā)生與發(fā)展中的作用備受關(guān)注,但microRNA-100在肝細胞肝癌起的具體作用及其如何引起肝細胞肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制尚不十分明確,本研究進一步探討microRNA-100導(dǎo)致肝細胞肝癌細胞侵襲及遷移的可能機制,從而為肝細胞肝癌的臨床診斷和治療提供新的線索,為尋找肝細胞肝癌新的治療靶點奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。目的本實驗通過探討microRNA-100在肝細胞肝癌中的表達及其對肝細胞肝癌細胞的遷移和侵襲的影響,進而研究microRNA-100在肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,進一步探討microRNA-100導(dǎo)致肝細胞肝癌細胞侵襲及遷移的可能機制,為尋找肝細胞肝癌新的治療靶點奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法1.運用qRT-PCR的方法探討microRNA-100在肝細胞肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達情況,進而分析microRNA-100的表達與肝細胞肝癌患者的預(yù)后和臨床病理學(xué)特征之間的相互關(guān)系。2.運用qRT-PCR的方法檢測了HepG2,Huh7,Hep3B,MHCC97L,SMMC7721和MHCC97H肝癌細胞系以及人類永生化肝細胞系LO2中microRNA-100的表達情況,進一步探討microRNA-100的表達水平對肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面的影響程度。3.運用免疫組化的方法檢測了肝癌組織中SNAI1蛋白、Vementin蛋白及E-cadherin蛋白的表達水平,并分析了它們的表達量與microRNA-100的相關(guān)性。4.應(yīng)用microRNA-100inhibitor及microRNA-100mimics轉(zhuǎn)染MHCC97H和SMMC7721細胞,然后分別運用Transwell侵襲實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲及遷移能力的變化。5.應(yīng)用microRNA-100mimics及microRNA-100inhibitor轉(zhuǎn)染MHCC97H和SMMC7721細胞后,運用western-blot法檢測細胞中Vementin及E-cadherin蛋白表達量的變化。6.應(yīng)用microRNA-100mimic及microRNA-100inhibitor分別與SNAI1過表達載體共轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞,然后運用劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測細胞遷移及侵襲能力的變化。7.應(yīng)用microRNA-100mimics及microRNA-100inhibitor轉(zhuǎn)染MHCC97H和SMMC7721細胞,然后分別運用qRT-PCR及western-blot法檢測細胞中SNAI1 mRNA及蛋白的表達變化。8.運用熒光素酶報告基因驗證microRNA-100是否通過與SNAI1的3、-UTR區(qū)結(jié)合而對其產(chǎn)生了抑制作用。9.應(yīng)用microRNA-100mimics或microRNA-100inhibitor分別與SNAI1過表達載體共轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞,然后運用western-blot法檢測細胞中E-cadherin及Vementin蛋白表達量的變化。結(jié)果1.microRNA-100在肝癌組織中較相應(yīng)癌旁組織中的表達明顯下調(diào),且microRNA-100的表達下調(diào)與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移,較晚TNM分期和較高的Edmonson分級顯著相關(guān)(P0.05);進一步用多因素COX回歸分析及Kaplan Meier生存曲線顯示microRNA-100的下調(diào)預(yù)示了肝細胞肝癌患者較短的無病生存期(HR=2.7;P=0.003)。2.在所有檢測的肝細胞系中均能測到microRNA-100的表達,microRNA-100在MHCC-97H細胞中表達最低,而在正常永生化的LO2細胞中表達最高。在肝癌組織標本中,轉(zhuǎn)移組中的microRNA-100的表達水平明顯低于非轉(zhuǎn)移組(P0.001)。3.microRNA-100過表達抑制了MHCC97H和SMMC7721細胞的遷移和侵襲;敲低miR-100則促進了MHCC97H和SMMC7721細胞的遷移和侵襲。4.在MHCC97H和SMMC7721細胞中,敲低microRNA-100則促進了Vimentin蛋白的表達,抑制了E-cadherin蛋白的表達;過表達microRNA-100促進了E-cadherin蛋白的表達,抑制了Vimentin蛋白的表達。5.在70例肝細胞肝癌組織中,microRNA-100的水平與E-cadherin蛋白的表達量呈正相關(guān)(r=0.639 P0.01);與Vimentin蛋白的表達量呈負相關(guān)(r=-0.456,P0.01)。6.SNAI1是microRNA-100的直接靶標。7.在MHCC97H和SMMC7721細胞中,過表達microRNA-100抑制了SNAI1 mRNA及蛋白的表達;敲低microRNA-100則促進了SNAI1 mRNA及蛋白的表達。8.在70例HCC組織中,microRNA-100的水平與SNAI1蛋白的表達量呈負相關(guān)(r=-0.615,P0.001)。microRNA-100通過作用于SNAI1,影響了細胞的遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的改變。結(jié)論1.microRNA-100的表達降低或缺失對肝癌細胞的抑制作用降低,下調(diào)的microRNA-100是通過促進SNAI1的表達進而促進了細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的改變,從而引起了細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.在肝細胞肝癌中,下調(diào)的microRNA-100促進了細胞的侵襲遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的改變。3.microRNA-100在肝細胞肝癌組織中較癌旁組織的表達明顯下調(diào),microRNA-100的低表達與肝細胞肝癌多個惡性臨床病理學(xué)指標密切相關(guān),且與肝細胞肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。4.microRNA-100有望作為肝細胞肝癌患者潛在的預(yù)后指示因子。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.7
【圖文】：

計數(shù)的方法來統(tǒng)計我們的實驗結(jié)果對這 5 個視野進行侵襲細胞的計數(shù)實驗結(jié)果的準確性，我們需要對每驗報告實驗報告基因的載體本實驗流程是：我們先設(shè)計并合成們實驗要的目的片段，然后通過目的入酶切后的報告基因載體上。我們中，然后我們先行 PCR鑒定長出的成功的含目的序列的報告基因載體面的圖 1-8 所示：Synthetic poly(A)

結(jié)果 肝癌及其癌旁組織中 microRNA-100 的表達水平.1 肝癌組織中的 microRNA-100 表達水平明顯低于其癌旁組織中的表a 本研究收集了 70 例肝癌組織及對應(yīng)癌旁組織標本，運用 qRT-roRNA-100 在肝細胞肝癌組織中的表達水平，檢測了 microRNA-100 在肝癌中的表達情況。b 結(jié)果顯示：microRNA-100 在 HCC 組織中較相應(yīng)癌旁組織中均有不同程 microRNA-100 在 HCC 組織中較相應(yīng)癌旁組織中表達下調(diào)的病例占到全8 /70 例，圖 2-1），以下將研究 microRNA-100 在肝細胞肝癌中的侵襲制。

microRNA-100在肝癌轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中表達水平的比較（***P<0.001；內(nèi)參為RUN6B）

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本文編號：2793949