【摘要】：背景根據(jù)病理類(lèi)型的不同,肝癌可分為肝細(xì)胞性肝癌、膽管細(xì)胞性肝癌和混合性肝癌,其中90%屬于肝細(xì)胞性肝癌~([1])。因此本研究主要討論是肝細(xì)胞性肝癌。肝癌因預(yù)后差,死亡率高,被稱(chēng)為癌中之王~([2-3])。肝癌的發(fā)生發(fā)展具有起病隱匿、臨床癥狀、體征不典型及病情進(jìn)展迅速等特點(diǎn),從而導(dǎo)致其發(fā)病率和死亡率逐年升高~([4])。由于肝癌的存活率低,發(fā)病較為隱匿,多數(shù)肝癌確診已為中晚期,已失去有效治療的機(jī)會(huì),因此肝癌的早期診斷就顯得十分重要。肝癌預(yù)后差,肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者療效和獲得長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵問(wèn)題~([5])。目前,肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不十分清楚,隨著對(duì)肝癌的深入研究,特別是分子生物學(xué)的進(jìn)步,肝癌的基因治療逐漸成為臨床應(yīng)用中很具前景的靶向治療,尋找新的有效的治療手段成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一~([6,7])。肝細(xì)胞肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過(guò)程,其中降解細(xì)胞外細(xì)胞外屏障是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的始動(dòng)步驟~([8,9])。微小RNA(MicroRNAs,miRNAS)是一類(lèi)短小的,高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA,在真核生物中發(fā)現(xiàn)的可以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)功能,長(zhǎng)度約21-25個(gè)核苷酸(nt)。MicroRNAs(miRNAS)在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。大量的MicroRNAs(miRNAS)的靶基因是抑癌基因或癌基因,且多個(gè)MicroRNAs(miRNAS)分子被證實(shí)參與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)。微小RNA能夠識(shí)別特定目標(biāo)mRNA或抑制蛋白翻譯,從而轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。超過(guò)一半的人類(lèi)MicroRNAs(miRNAS)基因位于脆弱位點(diǎn)或包含有腫瘤腫瘤相關(guān)基因的區(qū)域,而且MicroRNAs(miRNAS)有著廣泛的生物學(xué)功能,包含了細(xì)胞的凋亡、增殖、代謝、分化及腫瘤的生長(zhǎng)調(diào)控及形成過(guò)程等。MicroRNAs(miRNAS)沉默靶基因的主要分子生物學(xué)機(jī)制是通過(guò)MicroRNAs(miRNAS)保守的種子區(qū)域序列(約2-7個(gè)核苷酸(nt))特異的結(jié)合靶基因的3-UTR而實(shí)現(xiàn)的。RNA技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的基因沉默技術(shù),是利用雙鏈RNA特異性地降解具有同源序列的mRNA,從而沉默相應(yīng)基因的表達(dá)~([10-13])。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是細(xì)胞由上皮狀態(tài)向間質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)化的過(guò)程,它也是細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要特點(diǎn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化對(duì)于腫瘤的惡化發(fā)展都具有重要的影響,能夠顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。在EMT過(guò)程中,上皮功能的喪失以及間質(zhì)功能的獲得顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。E-cadherin是上皮細(xì)胞的特異分子標(biāo)記物,Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的特異分子標(biāo)記物,因此Vimentin蛋白的獲得以及E-cadherin蛋白的丟失表明細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化~([14-16])。SNAI1(snail)是一個(gè)與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,它能夠抑制E-cadherin表達(dá)并促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起到了關(guān)鍵作用,并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)~([17-19])。在多種腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中,都出現(xiàn)了SNAI1的異常表達(dá)。近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)顯示,SNAI1在EMT的調(diào)節(jié)過(guò)程中具有十分重要的作用。此外SNAI1誘導(dǎo)的E-cadherin下調(diào)被證實(shí)在觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用~([20-21])。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的復(fù)雜的過(guò)程,包括在血液循環(huán)中的轉(zhuǎn)運(yùn),對(duì)周?chē)M織的浸潤(rùn)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶的形成等多個(gè)環(huán)節(jié),在以上過(guò)程中,肝癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是一個(gè)特征性事件~([22-24])。microRNA-100定位于人類(lèi)染色體11q24.1,大小約為22個(gè)核苷酸,位于人染色體11q24.1,其種子序列區(qū)含有雙GC對(duì),另一末端為T(mén)A,這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定其靶基因種類(lèi)少,種子序列區(qū)結(jié)合力強(qiáng)~([25-27])。既往的研究表明,microRNA-100在不同的病變中呈現(xiàn)不同的表達(dá)方式。既往的研究發(fā)現(xiàn),在膀胱癌的細(xì)胞、組織中,microRNA-100的表達(dá)是下調(diào)的,體外過(guò)表達(dá)microRNA-100是能夠?qū)Π螂装┘?xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移起到抑制作用~([29-30])�，F(xiàn)已證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中,miRNA-99a/100通過(guò)mTOR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)并改變細(xì)胞的增值遷移功能~([31-32])。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)microRNA-100在正常的人肝細(xì)胞中高表達(dá),而在肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞株中低表達(dá)。隋承光的研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)的microRNA-100通過(guò)抑制mTOR的表達(dá)抑制肝癌的遷移和侵襲能力,主要通過(guò)上調(diào)上調(diào)E-cadherin的表達(dá),阻斷了EMT的發(fā)生過(guò)程~([33])。近年來(lái),microRNA-100在肝癌的發(fā)生與發(fā)展中的作用備受關(guān)注,但microRNA-100在肝細(xì)胞肝癌起的具體作用及其如何引起肝細(xì)胞肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不十分明確,本研究進(jìn)一步探討microRNA-100導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞侵襲及遷移的可能機(jī)制,從而為肝細(xì)胞肝癌的臨床診斷和治療提供新的線索,為尋找肝細(xì)胞肝癌新的治療靶點(diǎn)奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。目的本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討microRNA-100在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及其對(duì)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響,進(jìn)而研究microRNA-100在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用,進(jìn)一步探討microRNA-100導(dǎo)致肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞侵襲及遷移的可能機(jī)制,為尋找肝細(xì)胞肝癌新的治療靶點(diǎn)奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法1.運(yùn)用qRT-PCR的方法探討microRNA-100在肝細(xì)胞肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況,進(jìn)而分析microRNA-100的表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者的預(yù)后和臨床病理學(xué)特征之間的相互關(guān)系。2.運(yùn)用qRT-PCR的方法檢測(cè)了HepG2,Huh7,Hep3B,MHCC97L,SMMC7721和MHCC97H肝癌細(xì)胞系以及人類(lèi)永生化肝細(xì)胞系LO2中microRNA-100的表達(dá)情況,進(jìn)一步探討microRNA-100的表達(dá)水平對(duì)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面的影響程度。3.運(yùn)用免疫組化的方法檢測(cè)了肝癌組織中SNAI1蛋白、Vementin蛋白及E-cadherin蛋白的表達(dá)水平,并分析了它們的表達(dá)量與microRNA-100的相關(guān)性。4.應(yīng)用microRNA-100inhibitor及microRNA-100mimics轉(zhuǎn)染MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞,然后分別運(yùn)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲及遷移能力的變化。5.應(yīng)用microRNA-100mimics及microRNA-100inhibitor轉(zhuǎn)染MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞后,運(yùn)用western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中Vementin及E-cadherin蛋白表達(dá)量的變化。6.應(yīng)用microRNA-100mimic及microRNA-100inhibitor分別與SNAI1過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞,然后運(yùn)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化。7.應(yīng)用microRNA-100mimics及microRNA-100inhibitor轉(zhuǎn)染MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞,然后分別運(yùn)用qRT-PCR及western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中SNAI1 mRNA及蛋白的表達(dá)變化。8.運(yùn)用熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證microRNA-100是否通過(guò)與SNAI1的3、-UTR區(qū)結(jié)合而對(duì)其產(chǎn)生了抑制作用。9.應(yīng)用microRNA-100mimics或microRNA-100inhibitor分別與SNAI1過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染MHCC97H細(xì)胞,然后運(yùn)用western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin及Vementin蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果1.microRNA-100在肝癌組織中較相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)明顯下調(diào),且microRNA-100的表達(dá)下調(diào)與肝內(nèi)轉(zhuǎn)移,較晚TNM分期和較高的Edmonson分級(jí)顯著相關(guān)(P0.05);進(jìn)一步用多因素COX回歸分析及Kaplan Meier生存曲線顯示microRNA-100的下調(diào)預(yù)示了肝細(xì)胞肝癌患者較短的無(wú)病生存期(HR=2.7;P=0.003)。2.在所有檢測(cè)的肝細(xì)胞系中均能測(cè)到microRNA-100的表達(dá),microRNA-100在MHCC-97H細(xì)胞中表達(dá)最低,而在正常永生化的LO2細(xì)胞中表達(dá)最高。在肝癌組織標(biāo)本中,轉(zhuǎn)移組中的microRNA-100的表達(dá)水平明顯低于非轉(zhuǎn)移組(P0.001)。3.microRNA-100過(guò)表達(dá)抑制了MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞的遷移和侵襲;敲低miR-100則促進(jìn)了MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞的遷移和侵襲。4.在MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞中,敲低microRNA-100則促進(jìn)了Vimentin蛋白的表達(dá),抑制了E-cadherin蛋白的表達(dá);過(guò)表達(dá)microRNA-100促進(jìn)了E-cadherin蛋白的表達(dá),抑制了Vimentin蛋白的表達(dá)。5.在70例肝細(xì)胞肝癌組織中,microRNA-100的水平與E-cadherin蛋白的表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.639 P0.01);與Vimentin蛋白的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.456,P0.01)。6.SNAI1是microRNA-100的直接靶標(biāo)。7.在MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)microRNA-100抑制了SNAI1 mRNA及蛋白的表達(dá);敲低microRNA-100則促進(jìn)了SNAI1 mRNA及蛋白的表達(dá)。8.在70例HCC組織中,microRNA-100的水平與SNAI1蛋白的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.615,P0.001)。microRNA-100通過(guò)作用于SNAI1,影響了細(xì)胞的遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的改變。結(jié)論1.microRNA-100的表達(dá)降低或缺失對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用降低,下調(diào)的microRNA-100是通過(guò)促進(jìn)SNAI1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的改變,從而引起了細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.在肝細(xì)胞肝癌中,下調(diào)的microRNA-100促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的改變。3.microRNA-100在肝細(xì)胞肝癌組織中較癌旁組織的表達(dá)明顯下調(diào),microRNA-100的低表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌多個(gè)惡性臨床病理學(xué)指標(biāo)密切相關(guān),且與肝細(xì)胞肝癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。4.microRNA-100有望作為肝細(xì)胞肝癌患者潛在的預(yù)后指示因子。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7
【圖文】：

計(jì)數(shù)的方法來(lái)統(tǒng)計(jì)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)這 5 個(gè)視野進(jìn)行侵襲細(xì)胞的計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們需要對(duì)每驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體本實(shí)驗(yàn)流程是：我們先設(shè)計(jì)并合成們實(shí)驗(yàn)要的目的片段，然后通過(guò)目的入酶切后的報(bào)告基因載體上。我們中，然后我們先行 PCR鑒定長(zhǎng)出的成功的含目的序列的報(bào)告基因載體面的圖 1-8 所示：Synthetic poly(A)

結(jié)果 肝癌及其癌旁組織中 microRNA-100 的表達(dá)水平.1 肝癌組織中的 microRNA-100 表達(dá)水平明顯低于其癌旁組織中的表a 本研究收集了 70 例肝癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，運(yùn)用 qRT-roRNA-100 在肝細(xì)胞肝癌組織中的表達(dá)水平，檢測(cè)了 microRNA-100 在肝癌中的表達(dá)情況。b 結(jié)果顯示：microRNA-100 在 HCC 組織中較相應(yīng)癌旁組織中均有不同程 microRNA-100 在 HCC 組織中較相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)下調(diào)的病例占到全8 /70 例，圖 2-1），以下將研究 microRNA-100 在肝細(xì)胞肝癌中的侵襲制。

microRNA-100在肝癌轉(zhuǎn)移組及未轉(zhuǎn)移組中表達(dá)水平的比較（***P<0.001；內(nèi)參為RUN6B）

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本文編號(hào)：2793949