【摘要】：胃癌(Gastric carcinoma,GC),主要是指胃腺癌,在上消化道的惡性腫瘤中較為常見。根據(jù)2009~2011年中國(guó)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果預(yù)測(cè)胃癌在全國(guó)惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率均位居第2位。雖然早期胃癌的臨床表現(xiàn)不具有特征性,但隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)以及當(dāng)今腔鏡水平與診斷水平的提高,早期胃癌的診斷概率得到明顯提高。這不僅延長(zhǎng)了胃癌患者的生存時(shí)間,還相應(yīng)地提高了胃癌患者的生活質(zhì)量。而在精準(zhǔn)醫(yī)療的推動(dòng)下,從胃癌發(fā)生的源頭,即分子水平防止胃癌的發(fā)生已成為當(dāng)前科學(xué)研究的重中之重。在一些致癌因素的作用和影響下,基因組的穩(wěn)定性減弱:癌基因活性增強(qiáng),抑癌基因活性減弱以及腫瘤易感基因的突變,這些均能引起細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。micro RNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中作用明顯,其發(fā)揮作用的原理與調(diào)控靶基因的機(jī)制已得到大量研究證實(shí)。β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅲ(B4GALT3)是B4GALT家族的第3個(gè)成員,是合成多聚-N-乙酰氨基乳糖的關(guān)鍵酶,而多聚-N-乙酰氨基乳糖被修飾后表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原。至今,B4GALT3在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)以及對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚一無(wú)所知。目的:探討mi R-27a-3p對(duì)B4GALT3表達(dá)水平的影響以及對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為進(jìn)一步研究B4GALT3對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。方法:用Western blot檢測(cè)B4GALT3蛋白在胃癌細(xì)胞——SGC-7901(中分化)、MGC-803(低分化)、BGC-823(低分化)與正常胃粘膜細(xì)胞(GES-1)中的表達(dá)情況;運(yùn)用生物信息學(xué)方法獲取與B4GALT3靶向結(jié)合的最佳mi RNA。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,上調(diào)/下調(diào)BGC-823細(xì)胞中的mi R-27a-3p水平后,用Western blot檢測(cè)B4GALT3蛋白在BGC-823細(xì)胞中表達(dá)變化情況,進(jìn)而初步分析二者在胃癌細(xì)胞中的相互關(guān)系。采用MTT、劃痕、Transwell遷移與侵襲以及Western blot等實(shí)驗(yàn),觀察mi R-27a-3p對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:Western blot顯示B4GALT3在胃癌細(xì)胞系中高表達(dá);通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析與B4GALT3靶向結(jié)合且符合條件的mi RNAs有7個(gè),分別是:mi R-27a,mi R-27b,mi R-338-3p,mi R-125b,mi R-28-5p,mi R-379,mi R-491-5p;結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,我們選取mi R-27a進(jìn)行后續(xù)研究,并發(fā)現(xiàn)mi R-27a-3p與B4GALT3 3'UTR的213~220位點(diǎn)相結(jié)合,結(jié)合序列為5'-ACUGUGA-3',故選擇mi R-27a-3p進(jìn)行研究;Western blot結(jié)果顯示上調(diào)mi R-27a-3p后,B4GALT3蛋白表達(dá)水平下降,而抑制mi R-27a-3p后,B4GALT3蛋白表達(dá)增強(qiáng),P0.05。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在BGC-823細(xì)胞中上調(diào)mi R-27a-3p后,細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng),且在72 h~96 h處作用更明顯;相反,抑制mi R-27a-3p后,細(xì)胞增殖活性明顯減弱,P0.05。劃痕實(shí)驗(yàn)顯示,mi R-27a-3p mimic組的遷移距離高于對(duì)照組,抑制mi R-27a-3p后遷移距離明顯低于對(duì)照組,P0.05。Trasnwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示:mi R-27a-3p mimic組遷移通過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對(duì)照組;抑制mi R-27a-3p后,遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少,P0.05。Trasnwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示:mi R-27a-3p mimic組侵襲通過(guò)鋪有BD基質(zhì)膠小室的細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組,而抑制mi R-27a-3p后,細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組,P0.05。Western blot結(jié)果顯示:mi R-27a-3p mimic能使E-cadherin和Claudin-1表達(dá)下調(diào),使Vimentin、Slug和β-catenin表達(dá)上調(diào)(P0.05);相反,抑制mi R-27a-3p后,E-cadherin和Claudin-1表達(dá)上調(diào),而Vimentin、Slug和β-catenin表達(dá)下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:mi R-27a-3p可能通過(guò)抑制B4GALT3表達(dá)促進(jìn)BGC-823細(xì)胞的增殖活性、遷移和侵襲及EMT進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2
【圖文】：

化的主要成分—粘蛋白型 O-糖鏈糖基化在腫瘤中高表達(dá)，有利于腫瘤生物標(biāo)記物的研究[11]。B4GALT3（Gene ID: 8703），全稱 beta-1,4-galactosyltransferase 3，又稱beta4Gal-T3，位于染色體 1q23.3 上，是β1，4 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶家族中的第 3 個(gè)成員（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8703）。Zhang M 等人[14]利用人胎盤cDNA 文庫(kù)成功克隆出 B4GALT3，并指出在其編碼區(qū)第 77 位，119 位，190 位以及 209 位氨基酸處存在四個(gè)保守的半胱氨酸殘基，半胱氨酸殘基對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)中的二硫鍵形成至關(guān)重要[14, 15]。Henrik Clausen 等人[15]在 1997 年對(duì)B4GALT3 的全長(zhǎng)編碼序列的測(cè)序和克隆進(jìn)行了相關(guān)描述，指出 B4GALT3 序列編碼一個(gè)具有 4 個(gè)殘基胞漿域、18 個(gè)殘基穿膜域、1 個(gè)莖區(qū)或頸區(qū)域和 371 個(gè)殘基催化域以及具有 4 個(gè)潛在 N-鏈糖基化位點(diǎn)的Ⅱ型跨膜糖蛋白。B4GALT3 基因的結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示。而且 B4GALT3 的編碼區(qū)有 6 個(gè)外顯子[15]，在 5'-非翻譯區(qū)有一個(gè) 34 堿基的內(nèi)含子[16]，全部序列與 B4GALT1 具有 44%的序列同源性[15]。

第四章 結(jié) 果4.1 B4GALT3 在不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況Western blot 檢測(cè) B4GALT3 在胃癌 SGC-7901 細(xì)胞、MGC-803 細(xì)胞和BGC-823 細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平，并以 GES-1 細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果如圖 4.1 所示：相對(duì)于 GES-1 細(xì)胞，B4GALT3 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖 4.2 軟件預(yù)測(cè)與 B4GALT3 靶向結(jié)合的 miRNAs綠色代表該軟件預(yù)測(cè)有 miRNA 與 B4GALT3 結(jié)合；紅色代表該軟件沒有預(yù)測(cè)到 miRNA 與B4GALT3 有結(jié)合；黃色代表預(yù)測(cè)該 miRNA 的軟件總數(shù)。通過(guò) miRanda 對(duì)上一步篩選出的 miRNAs 進(jìn)行熱力學(xué)穩(wěn)定性和序列保守性評(píng)分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述 20 個(gè)靶 miRNAs 中同時(shí)滿足熱力學(xué)穩(wěn)定性評(píng)分（mirSVR）絕對(duì)值≥0.1，且序列保守性評(píng)分（PhastCons）在 0.5～0.7 之間的有7 個(gè)，分別是 miR-27a，miR-27b，miR-338-3p，miR-125b，miR-28-5p，miR-379，miR-491-5p，如圖 4.3 所示。其中評(píng)分位于前兩位的 miR-27a，miR-27b 屬同一家族，調(diào)控的靶基因類似。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)[24]，可得出 B4GALT3 是 miR-27a 潛在的分子靶向基因。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2789250