發(fā)布時(shí)間：2020-08-09 10:02

【摘要】：目的食管癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的消化道腫瘤,在我國(guó)惡性腫瘤死亡率中排第4位,在全球惡性腫瘤死亡率位列第6,外科手術(shù)是治療可切除食管癌首選的方法,但術(shù)后局部復(fù)發(fā)率高達(dá)40%-60%,而接近50%的食管癌患者確診的時(shí)候已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì),這些患者只能依賴(lài)于化學(xué)治療和放射治療,順鉑作為食管癌化療的一線藥物,對(duì)于食管癌的治療效果顯著。順鉑作為細(xì)胞毒性藥物殺死腫瘤細(xì)胞的機(jī)制主要是損傷和抑制DNA的合成。在此過(guò)程中激活了多種信號(hào)途徑(主要為凋亡途徑),從而避免或促進(jìn)細(xì)胞的死亡。近年來(lái),大量研究表明,自噬作為另一種細(xì)胞死亡形式,可單獨(dú)或與凋亡共同作用參與化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖球?yàn)證順鉑是否誘導(dǎo)食管癌EC109細(xì)胞的自噬,并進(jìn)一步探究自噬在順鉑誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞損傷中的作用,以及其發(fā)生作用的具體機(jī)制。方法(1)研究對(duì)象:體外培養(yǎng)人食管鱗癌EC109細(xì)胞株,使用不同濃度的順鉑處理EC109細(xì)胞不同的時(shí)間點(diǎn),濃度梯度為1u M、2.5u M、5u M、7.5u M、10u M,每個(gè)濃度設(shè)0h、12h、24h、48h、72h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力,計(jì)算出IC50劑量并確定下一步順鉑干預(yù)的濃度及作用的時(shí)間。(2)順鉑干預(yù)濃度和時(shí)間點(diǎn)的選取與分組:根據(jù)CCK-8檢測(cè)結(jié)果,選取5umol/L順鉑,建立不同時(shí)間點(diǎn)順鉑處理模型,設(shè)正常對(duì)照組(NC)、順鉑處理24h組、順鉑處理48h組、順鉑處理72h組。建立不同濃度順鉑處理72小時(shí)模型,設(shè)正常對(duì)照組(NC)、順鉑濃度1u M組、順鉑濃度2.5u M組、順鉑濃度5u M組。檢測(cè)指標(biāo):通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)各組EC109細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3-II和Beclin1的表達(dá)水平、自噬底物蛋白p62及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、XIAP的表達(dá)水平;免疫熒光檢測(cè)各組EC109細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3的表達(dá);TUNEL法檢測(cè)各組EC109細(xì)胞的凋亡率。(3)藥物干預(yù)與分組:給予自噬抑制劑氯喹干預(yù)EC109細(xì)胞,設(shè)正常對(duì)照組、氯喹處理組、順鉑處理組、順鉑+氯喹干預(yù)組。選取EC109細(xì)胞自噬及凋亡表達(dá)最明顯的順鉑處理時(shí)間點(diǎn)和濃度進(jìn)行處理,即5u M順鉑,處理72h。氯喹預(yù)處理方法:氯喹稀釋液在順鉑處理前給予預(yù)處理2h。檢測(cè)指標(biāo):免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組EC109細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3-II、凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及XIAP蛋白的表達(dá)變化;TUNEL法檢測(cè)各組EC109細(xì)胞的凋亡率。(4)Si RNA轉(zhuǎn)染與分組:給予Si RNA干預(yù)Atg5的表達(dá),設(shè)正常對(duì)照組、Si RNAAtg5干預(yù)組、順鉑處理組、順鉑+Si RNAAtg5干預(yù)組。選取EC109細(xì)胞自噬及凋亡表達(dá)最明顯的順鉑處理時(shí)間點(diǎn)和濃度進(jìn)行處理,即5u M順鉑,處理72h。Si RNAAtg5預(yù)處理方法:Si RNAAtg5在順鉑處理前給予轉(zhuǎn)染處理6h。檢測(cè)指標(biāo):免疫印跡技術(shù)檢測(cè)各組EC109細(xì)胞Atg5、LC3-II、cleaved-caspase-3、及XIAP蛋白的表達(dá)水平;TUNEL法檢測(cè)各組EC109細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果(1)CCK-8結(jié)果顯示,EC109細(xì)胞對(duì)順鉑的作用敏感,順鉑對(duì)EC109細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量濃度效應(yīng)。隨著時(shí)間及濃度的增加,細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增加(P0.05)。5u M順鉑處理組,細(xì)胞增殖抑制率在所有12h、24h、48h、72h均小于50%。(2)順鉑處理不同時(shí)間點(diǎn)EC109細(xì)胞自噬的檢測(cè):免疫印跡結(jié)果示:順鉑處理組自噬標(biāo)記蛋白自噬標(biāo)記蛋白LC3-II、Beclin1表達(dá)明顯增多,5u M順鉑處理72h組表達(dá)最多,與正常對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);自噬底物蛋白p62表達(dá)明顯減少,且隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸減少,5u M順鉑處理72h組表達(dá)最少,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光結(jié)果示:隨著順鉑濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),EC109細(xì)胞LC3-II綠色熒光點(diǎn)增加,5u M順鉑處理72h組表達(dá)最高,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)順鉑處理不同時(shí)間點(diǎn)EC109細(xì)胞凋亡及XIAP表達(dá)的檢測(cè):免疫印跡結(jié)果示:隨著順鉑濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),EC109細(xì)胞cleaved caspase-3表達(dá)逐漸增多,5u M順鉑處理72h組表達(dá)最多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);EC109細(xì)胞XIAP表達(dá)逐漸減少,5u M順鉑處理72h組表達(dá)最少,與正常對(duì)照組相比,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。TUNEL結(jié)果示:隨著順鉑濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),EC109細(xì)胞凋亡陽(yáng)性點(diǎn)表達(dá)逐漸增多5u M順鉑處理72h組表達(dá)最多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)氯喹干預(yù)對(duì)EC109細(xì)胞自噬及凋亡的影響:免疫印跡結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組LC3-II表達(dá)增多(P0.05),順鉑+氯喹組LC3-II表達(dá)較順鉑組明顯增多(P0.05);與NC組相比,順鉑組cleaved caspase-3表達(dá)增多,順鉑+氯喹組cleaved caspase-3表達(dá)較順鉑組明顯減少(P0.05)。TUNEL結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組EC109細(xì)胞凋亡陽(yáng)性點(diǎn)表達(dá)增多(P0.05),順鉑+氯喹組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性點(diǎn)表達(dá)較順鉑組明顯減少(P0.05)。(5)Si RNA干預(yù)EC109細(xì)胞自噬及凋亡的影響:免疫印跡結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組LC3-II和cleaved caspase-3表達(dá)增多(P0.05),順鉑+Si RNA組LC3-II和cleaved caspase-3表達(dá)較順鉑組明顯減少(P0.05)。TUNEL結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組EC109細(xì)胞凋亡陽(yáng)性點(diǎn)表達(dá)增多(P0.05),順鉑+Si RNA組細(xì)胞凋亡陽(yáng)性點(diǎn)表達(dá)較順鉑組明顯減少(P0.05)。(6)干預(yù)自噬對(duì)XIAP表達(dá)的影響:免疫印跡結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組EC109細(xì)胞XIAP表達(dá)減少(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+氯喹組和順鉑+Si RNA組XIAP表達(dá)增多(P0.05)。結(jié)論本研究證實(shí):(1)順鉑處理后EC109細(xì)胞凋亡增多,并且伴隨著自噬的激活以及XIAP表達(dá)減少;(2)氯喹抑制自噬以及Si RNA Atg5干預(yù)自噬后,給予順鉑處理,凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3表達(dá)減少,細(xì)胞凋亡率減低;(3)氯喹抑制自噬以及Si RNA Atg5干預(yù)自噬后,XIAP表達(dá)增多。綜上所述,得出結(jié)論:(1)順鉑誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞自噬的激活;(2)自噬激活加重了順鉑所致食管癌細(xì)胞損傷;(3)自噬可能是通過(guò)過(guò)度清除XIAP而加重食管癌細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1
【圖文】：

圖 2.1：不同濃度順鉑作用不同時(shí)間對(duì) EC109 細(xì)胞的活性的影響時(shí)間和不同濃度順鉑處理 EC109 細(xì)胞自噬、凋亡的檢測(cè)跡技術(shù)檢測(cè)順鉑處理后不同時(shí)間點(diǎn)和不同濃度 EC109 細(xì)胞中 疫印跡技術(shù)檢測(cè)順鉑處理 0h、24h、48h、72h 四個(gè)時(shí)間點(diǎn)和 0M、5uM 四個(gè)濃度梯度內(nèi)自噬相關(guān)蛋白 LC3-II 的表達(dá)結(jié)果顯示比，順鉑處理組 LC3-II 的表達(dá)明顯增多，且隨著藥物作用時(shí)間的表達(dá)也逐漸增多。5uM 順鉑處理 72h 表達(dá)最多。差異具有統(tǒng)計(jì)5）。見(jiàn)圖 2.2A、2.2B、2.2C、2.2D。

5uM 濃度順鉑處理不同時(shí)間點(diǎn) LC3-II 蛋白表達(dá)影響的統(tǒng)（*P<0.05；**P<0.01）圖 2.2C：不同濃度順鉑處理 72h LC3-II 蛋白表：NC：正常對(duì)照組；uM：不同濃度順鉑處理 72h 組。GA

科大學(xué)碩士學(xué)位論文 二、結(jié)圖 2.2A：5uM 濃度順鉑處理不同時(shí)間點(diǎn) LC3-II 蛋白表達(dá)的影響注：NC：正常對(duì)照組；24h、48h、72h：5uM 順鉑不同處理時(shí)間組。GAPDH：內(nèi)圖 2.2B：5uM 濃度順鉑處理不同時(shí)間點(diǎn) LC3-II 蛋白表達(dá)影響的統(tǒng)計(jì)分析（*P<0.05；**P<0.01）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李夢(mèng)琪;劉卓剛;;自噬對(duì)慢性髓系白血病的雙重作用[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2015年02期

本文編號(hào)：2786962