【摘要】：目的食管癌是全球范圍內(nèi)常見的消化道腫瘤,在我國惡性腫瘤死亡率中排第4位,在全球惡性腫瘤死亡率位列第6,外科手術(shù)是治療可切除食管癌首選的方法,但術(shù)后局部復發(fā)率高達40%-60%,而接近50%的食管癌患者確診的時候已有遠處轉(zhuǎn)移,失去了手術(shù)切除的機會,這些患者只能依賴于化學治療和放射治療,順鉑作為食管癌化療的一線藥物,對于食管癌的治療效果顯著。順鉑作為細胞毒性藥物殺死腫瘤細胞的機制主要是損傷和抑制DNA的合成。在此過程中激活了多種信號途徑(主要為凋亡途徑),從而避免或促進細胞的死亡。近年來,大量研究表明,自噬作為另一種細胞死亡形式,可單獨或與凋亡共同作用參與化療藥物對腫瘤細胞的影響。本實驗目的是驗證順鉑是否誘導食管癌EC109細胞的自噬,并進一步探究自噬在順鉑誘導食管癌細胞損傷中的作用,以及其發(fā)生作用的具體機制。方法(1)研究對象:體外培養(yǎng)人食管鱗癌EC109細胞株,使用不同濃度的順鉑處理EC109細胞不同的時間點,濃度梯度為1u M、2.5u M、5u M、7.5u M、10u M,每個濃度設(shè)0h、12h、24h、48h、72h五個時間點。用CCK-8法檢測細胞活力,計算出IC50劑量并確定下一步順鉑干預的濃度及作用的時間。(2)順鉑干預濃度和時間點的選取與分組:根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果,選取5umol/L順鉑,建立不同時間點順鉑處理模型,設(shè)正常對照組(NC)、順鉑處理24h組、順鉑處理48h組、順鉑處理72h組。建立不同濃度順鉑處理72小時模型,設(shè)正常對照組(NC)、順鉑濃度1u M組、順鉑濃度2.5u M組、順鉑濃度5u M組。檢測指標:通過免疫印跡法檢測各組EC109細胞自噬標記蛋白LC3-II和Beclin1的表達水平、自噬底物蛋白p62及凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、XIAP的表達水平;免疫熒光檢測各組EC109細胞自噬標記蛋白LC3的表達;TUNEL法檢測各組EC109細胞的凋亡率。(3)藥物干預與分組:給予自噬抑制劑氯喹干預EC109細胞,設(shè)正常對照組、氯喹處理組、順鉑處理組、順鉑+氯喹干預組。選取EC109細胞自噬及凋亡表達最明顯的順鉑處理時間點和濃度進行處理,即5u M順鉑,處理72h。氯喹預處理方法:氯喹稀釋液在順鉑處理前給予預處理2h。檢測指標:免疫印跡技術(shù)檢測各組EC109細胞自噬標記蛋白LC3-II、凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3及XIAP蛋白的表達變化;TUNEL法檢測各組EC109細胞的凋亡率。(4)Si RNA轉(zhuǎn)染與分組:給予Si RNA干預Atg5的表達,設(shè)正常對照組、Si RNAAtg5干預組、順鉑處理組、順鉑+Si RNAAtg5干預組。選取EC109細胞自噬及凋亡表達最明顯的順鉑處理時間點和濃度進行處理,即5u M順鉑,處理72h。Si RNAAtg5預處理方法:Si RNAAtg5在順鉑處理前給予轉(zhuǎn)染處理6h。檢測指標:免疫印跡技術(shù)檢測各組EC109細胞Atg5、LC3-II、cleaved-caspase-3、及XIAP蛋白的表達水平;TUNEL法檢測各組EC109細胞的凋亡率。結(jié)果(1)CCK-8結(jié)果顯示,EC109細胞對順鉑的作用敏感,順鉑對EC109細胞增殖的抑制作用呈劑量濃度效應(yīng)。隨著時間及濃度的增加,細胞增殖的抑制作用明顯增加(P0.05)。5u M順鉑處理組,細胞增殖抑制率在所有12h、24h、48h、72h均小于50%。(2)順鉑處理不同時間點EC109細胞自噬的檢測:免疫印跡結(jié)果示:順鉑處理組自噬標記蛋白自噬標記蛋白LC3-II、Beclin1表達明顯增多,5u M順鉑處理72h組表達最多,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);自噬底物蛋白p62表達明顯減少,且隨著藥物濃度的增加及作用時間的延長表達逐漸減少,5u M順鉑處理72h組表達最少,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫熒光結(jié)果示:隨著順鉑濃度的增加及作用時間的延長,EC109細胞LC3-II綠色熒光點增加,5u M順鉑處理72h組表達最高,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(3)順鉑處理不同時間點EC109細胞凋亡及XIAP表達的檢測:免疫印跡結(jié)果示:隨著順鉑濃度的增加及作用時間的延長,EC109細胞cleaved caspase-3表達逐漸增多,5u M順鉑處理72h組表達最多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);EC109細胞XIAP表達逐漸減少,5u M順鉑處理72h組表達最少,與正常對照組相比,其差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。TUNEL結(jié)果示:隨著順鉑濃度的增加及作用時間的延長,EC109細胞凋亡陽性點表達逐漸增多5u M順鉑處理72h組表達最多,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。(4)氯喹干預對EC109細胞自噬及凋亡的影響:免疫印跡結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組LC3-II表達增多(P0.05),順鉑+氯喹組LC3-II表達較順鉑組明顯增多(P0.05);與NC組相比,順鉑組cleaved caspase-3表達增多,順鉑+氯喹組cleaved caspase-3表達較順鉑組明顯減少(P0.05)。TUNEL結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組EC109細胞凋亡陽性點表達增多(P0.05),順鉑+氯喹組細胞凋亡陽性點表達較順鉑組明顯減少(P0.05)。(5)Si RNA干預EC109細胞自噬及凋亡的影響:免疫印跡結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組LC3-II和cleaved caspase-3表達增多(P0.05),順鉑+Si RNA組LC3-II和cleaved caspase-3表達較順鉑組明顯減少(P0.05)。TUNEL結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組EC109細胞凋亡陽性點表達增多(P0.05),順鉑+Si RNA組細胞凋亡陽性點表達較順鉑組明顯減少(P0.05)。(6)干預自噬對XIAP表達的影響:免疫印跡結(jié)果示:與NC組相比,順鉑組EC109細胞XIAP表達減少(P0.05);與順鉑組相比,順鉑+氯喹組和順鉑+Si RNA組XIAP表達增多(P0.05)。結(jié)論本研究證實:(1)順鉑處理后EC109細胞凋亡增多,并且伴隨著自噬的激活以及XIAP表達減少;(2)氯喹抑制自噬以及Si RNA Atg5干預自噬后,給予順鉑處理,凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase3表達減少,細胞凋亡率減低;(3)氯喹抑制自噬以及Si RNA Atg5干預自噬后,XIAP表達增多。綜上所述,得出結(jié)論:(1)順鉑誘導食管癌細胞自噬的激活;(2)自噬激活加重了順鉑所致食管癌細胞損傷;(3)自噬可能是通過過度清除XIAP而加重食管癌細胞的凋亡。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.1
【圖文】：

圖 2.1：不同濃度順鉑作用不同時間對 EC109 細胞的活性的影響時間和不同濃度順鉑處理 EC109 細胞自噬、凋亡的檢測跡技術(shù)檢測順鉑處理后不同時間點和不同濃度 EC109 細胞中 疫印跡技術(shù)檢測順鉑處理 0h、24h、48h、72h 四個時間點和 0M、5uM 四個濃度梯度內(nèi)自噬相關(guān)蛋白 LC3-II 的表達結(jié)果顯示比，順鉑處理組 LC3-II 的表達明顯增多，且隨著藥物作用時間的表達也逐漸增多。5uM 順鉑處理 72h 表達最多。差異具有統(tǒng)計5）。見圖 2.2A、2.2B、2.2C、2.2D。

5uM 濃度順鉑處理不同時間點 LC3-II 蛋白表達影響的統(tǒng)（*P<0.05；**P<0.01）圖 2.2C：不同濃度順鉑處理 72h LC3-II 蛋白表：NC：正常對照組；uM：不同濃度順鉑處理 72h 組。GA

科大學碩士學位論文 二、結(jié)圖 2.2A：5uM 濃度順鉑處理不同時間點 LC3-II 蛋白表達的影響注：NC：正常對照組；24h、48h、72h：5uM 順鉑不同處理時間組。GAPDH：內(nèi)圖 2.2B：5uM 濃度順鉑處理不同時間點 LC3-II 蛋白表達影響的統(tǒng)計分析（*P<0.05；**P<0.01）

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李夢琪;劉卓剛;;自噬對慢性髓系白血病的雙重作用[J];中國實驗血液學雜志;2015年02期

本文編號：2786962