【摘要】：第一部分 結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤分子標志物的篩查背景：大腸癌(Colorectal cancer, CRC)是當前全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率都處于惡性腫瘤前列。由于人們生活方式及飲食機構(gòu)的西方化,我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率亦逐年增加。結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤(laterally spreading tumors, LSTs)為直徑≥10mm的結(jié)直腸平坦型腫瘤性病變,是結(jié)直腸癌的重要癌前病變,其起病隱匿,早期常無明顯的臨床癥狀,多在常規(guī)結(jié)腸鏡檢查時發(fā)現(xiàn)。LSTs在早期大腸癌中約占6%,我科研究發(fā)現(xiàn)LSTs常規(guī)結(jié)腸鏡檢出率為0.8%,癌變率占11.5%,故此病在我國發(fā)病率并不低。LSTs因其呈側(cè)向和沿腸壁環(huán)周生長,且其進展為黏膜下浸潤癌的機率小于近似大小的隆起型病變,故LSTs更適合于內(nèi)鏡下切除治療。但LSTs術(shù)后復發(fā)率較高,易導致LSTs復發(fā)甚至癌變。蛋白質(zhì)組學應用于臨床疾病如腫瘤的研究,主要是鑒定機體在正常生理狀態(tài)與異常疾病狀態(tài)下的蛋白質(zhì)表達水平,并對這些不同狀態(tài)下差異表達的蛋白質(zhì)進行定量分析。定量蛋白質(zhì)組(quantitative proteomics)是從蛋白質(zhì)組學水平上對基因表達進行準確的定量分析,是比較蛋白質(zhì)組學的核心研究內(nèi)容,目前廣泛應用于疾病發(fā)病機制以及藥理調(diào)控機制等研究。同位素標記相對和絕對定量技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是由美國ABI應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation, ABI, USA)2004年研發(fā)的新的體外同位素標記技術(shù)。其主要流程是蛋白酶切后形成多肽,用iTRAQ同位素試劑標記多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團。標記后的肽段經(jīng)過液相分離,進行一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜分析,在二級質(zhì)譜前,被標記的不同樣本中的同一肽段表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比和其他理化性質(zhì)。而在二級質(zhì)譜中,信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114-121)的峰,根據(jù)波峰的高度及面積,可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。iTRAQ與傳統(tǒng)的雙向電泳定量分析相比具有以下技術(shù)優(yōu)勢：1、標簽種類多,可同時對8個樣本進行分析；2、體外標記,適用于所有生物樣本；3、靈敏度高,檢測限低,可檢測出低豐度蛋白；4、分離能力強,分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質(zhì)進行分離鑒定,包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白；5、結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；6、自動化程度高：液相與質(zhì)譜連用,自動化操作,分析速度快,分離效果好。但iTRAQ技術(shù)對檢測標本的蛋白含量要求較高：蛋白總量不少于50ug,蛋白濃度最低不少于5ug/uL,否則同位素無法標記。因iTRAQ操作過程更簡單,定性、定量同時進行,實驗結(jié)果可靠且重復性好,相對其他蛋白定量技術(shù)優(yōu)勢明顯,故其為目前主流的蛋白質(zhì)定量技術(shù)。目的：通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定并分析出結(jié)直腸LSTs特異性表達的蛋白質(zhì),以期找到導致其側(cè)向生長發(fā)育的可能的分子機制；同時探知與其病情進展相關(guān)的蛋白質(zhì)標記物,提高結(jié)直腸LSTs的早期診斷率、療效以及改善預后。方法：隨機收取結(jié)直腸LSTs大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉(dlcm)、大腸癌及正常對照組大腸組織標本,每組各20例。分別從各組織樣品中提取蛋白,加入胰酶消化,酶解后的多肽用同位素相對與絕對定量(iTRAQ)試劑進行標記,混合標記后的肽段,用強陽離子交換柱(SCX)和反相色譜柱(RPLC)進行二維分離,然后經(jīng)基于QE的液質(zhì)聯(lián)用進行液相串聯(lián)質(zhì)譜分析并進行蛋白質(zhì)定量鑒定,通過Mascot數(shù)據(jù)庫進行檢索得到結(jié)直腸LSTs患者的差異蛋白質(zhì)譜,并對其進行標準生物信息分析。結(jié)果：本研究通過同位素相對絕對定量(iTRAQ)技術(shù)聯(lián)合多維固／液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)研究策略,共鑒定到4955個蛋白,22587個肽段,其中含21095個Unique肽段。經(jīng)過比對分析,共有2001個蛋白被鑒定為差異表達蛋白,其中上調(diào)蛋白數(shù)量分別為：結(jié)直腸LSTs組/正常對照組361,結(jié)直腸LSTs組/隆起型腺瘤組189,結(jié)直腸LSTs組/扁平腺瘤組151,結(jié)直腸LSTs組/大腸癌組325；下調(diào)蛋白數(shù)量分別為：結(jié)直腸LSTs組/正常對照組318,結(jié)直腸LSTs組/隆起型腺瘤組201,結(jié)直腸LSTs組/扁平腺瘤組153,結(jié)直腸LSTs組/大腸癌組303；總差異蛋白數(shù)量分別為：結(jié)直腸LSTs組/正常對照組679,結(jié)直腸LSTs組/隆起型腺瘤組390,結(jié)直腸LSTs組/扁平腺瘤組304,結(jié)直腸LSTs組/大腸癌組628。(注：當?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達到1.2倍以上,且經(jīng)統(tǒng)計檢驗其P值小于0.05時,視為差異蛋白。)進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸LSTs存在著特異性表達的蛋白質(zhì),即結(jié)直腸LSTs與大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉、大腸癌組織及正常大腸粘膜組織相比,均存在著相同的差異性表達的蛋白質(zhì)共55個：共同上調(diào)的差異蛋白質(zhì)14個,共同下調(diào)的差異蛋白質(zhì)41個。根據(jù)GO功能注釋分析,被鑒定出的結(jié)直腸LSTs差異表達的蛋白質(zhì)中,具有結(jié)合功能的差異蛋白所占比例為49.54%,其次是具有酶催化活性作用的蛋白占28.39%,具有酶調(diào)節(jié)活性功能的差異蛋白占4.51%,其余差異表達的蛋白質(zhì)涉及免疫防御反應、血管新生等功能。而被鑒定出的結(jié)直腸LSTs55個差異表達的蛋白質(zhì)中以具有結(jié)合功能和運輸代謝功能的蛋白質(zhì)為主。結(jié)論：通過iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學技術(shù),我們成功地鑒定出了結(jié)直腸LSTs差異表達的蛋白質(zhì)譜,并篩選出一批結(jié)直腸LSTs特異性表達的蛋白質(zhì),其中多種蛋白質(zhì)具有結(jié)合功能、酶調(diào)節(jié)活性功能和運輸代謝等功能,提示結(jié)直腸LSTs差異表達的蛋白質(zhì)參與的細胞代謝過程與功能通路在其病程進展過程中發(fā)揮了重要的作用。第二部分結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤分子標志物的驗證與臨床評價背景：結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤(LSTs)患者包括其早期患者的診斷目前還沒有特異性好、敏感度高的標志物。對于結(jié)直腸LSTs發(fā)生、發(fā)展機制的研究,尤其是在分子水平的研究證實其由腺瘤轉(zhuǎn)化為癌的過程中伴隨著許多蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的改變,而其中涉及結(jié)直腸LSTs分化調(diào)控的特異性表達的蛋白質(zhì)可能會成為具有結(jié)直腸LSTs特征性的、并具有較高診斷價值的分子標志物及潛在的治療靶點。利用Western blot、血清ELISA和免疫組織化學方法可以對蛋白質(zhì)進行定量、定位研究,對疾病的診斷及預后方面具有重要意義。目的：對與結(jié)直腸LSTs特異性表達的蛋白質(zhì)進行鑒定及驗證。方法：隨機收取LSTs及正常對照組血清標本,每組各30例。應用RT-PCR的方法對結(jié)直腸LSTs組、隆起型腺瘤組、扁平腺瘤組、大腸癌組及正常對照組大腸組織中差異表達的蛋白質(zhì)進行mRNA水平的驗證。應用westernblot的方法驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結(jié)直腸LSTs、隆起型腺瘤、扁平腺瘤、大腸癌及正常大腸組織中的表達。采用ELISA雙抗夾心法和免疫組織化學驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結(jié)直腸LSTs及正常大腸組織中的表達水平。組間比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-Samples t Test)或單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法(滿足方差齊性時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett's T3法),Spearman(非雙變量正態(tài)分布資料或者等級資料,相關(guān)系數(shù)用rs表示)相關(guān)系數(shù)分析LCN2與MMP9蛋白表達以及免疫組化結(jié)果與臨床病理特征的相關(guān)性,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：我們選擇了4個與腫瘤病情進展密切相關(guān)但目前在LSTs研究領(lǐng)域報道較少的蛋白即LCN-2、SORD、RAB25. CPA3先進行Real Time PCR實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比,結(jié)直腸LSTs組中LCN-2、SORD、RAB25 mRNA表達顯著升高(P值分別為0.000,0.000,0.043), CPA3 mRNA表達顯著下降(P=0.000),其中LCN-2 mRNA在5組組織中差異表達的趨勢與蛋白組學結(jié)果最為一致。隨后對LCN-2及與其功能密切相關(guān)的且在LSTs組織中顯著上調(diào)的MMP9蛋白進行Western blot、免疫組化驗證,發(fā)現(xiàn)LCN-2、MMP9在結(jié)直腸LSTs組織中的表達較正常組顯著升高(P值分別為0.000,0.000)；且二者在組化中的表達強度相關(guān)分析結(jié)果表明：MMP-9蛋白表達與LCN-2蛋白表達存在正相關(guān)關(guān)系(rs=0.631,P=0.000)；且LCN-2、MMP-9蛋白表達均與病理分級存在正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為rs=0.943, P=0.000; rs=0.684, P=0.000)。結(jié)直腸LSTs患者血清LCN-2、MMP-9蛋白濃度均顯著高于正常對照組(P值分別為0.000,0.000)；MMP-9蛋白表達與LCN-2蛋白表達存在正相關(guān)關(guān)系(rs=0.815,P=0.000)；且LCN-2、MMP-9蛋白表達均與病理分級存在正相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為rs=0.927, P=0.000; rs=0.924, P=0.000)。結(jié)論：經(jīng)質(zhì)譜分析篩選出來的差異蛋白中,LCN-2和MMP-9在結(jié)直腸LSTs患者腫瘤組織及血清中的表達水平均顯著增高,且LCN-2在LSTs組織中的表達與其病理分級程度呈正相關(guān),提示LCN-2和MMP-9可能與LSTs病情發(fā)展密切相關(guān),為結(jié)直腸LSTs病情進展及分子標志物的研究提供了新的實驗依據(jù)。LCN-2蛋白對于提高結(jié)直腸LSTs早期診斷率及改善預后具有較大的臨床應用價值,可能成為預測結(jié)直腸LSTs診斷、預后監(jiān)測和防治的重要指標。第三部分結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤生長機制的初步探討背景：結(jié)直腸LSTs是一種特殊形態(tài)的平坦型大腸腺瘤,其具有以下特點：病變直徑≥10mm；生長方式為沿腸腔側(cè)向擴展或環(huán)周生長而非垂直向下生長；依據(jù)其表面形態(tài)特征分為顆粒型及非顆粒型。結(jié)直腸LSTs是進展期結(jié)直腸癌的重要癌前病變,病理以管狀絨毛腺瘤或管狀腺瘤為主。與隆起型腫瘤相比,結(jié)直腸LSTs有較高的凋亡指數(shù)和較低的增生指數(shù)。這樣特殊的細胞凋亡和細胞增生的動力學賦予結(jié)直腸LSTs獨特的表面特征,側(cè)向發(fā)育的生長方式、惡變后黏膜下浸潤發(fā)生率低和相對低惡性潛能。但既往的分子生物學研究主要集中于結(jié)直腸LSTs甲基化的研究,關(guān)于其側(cè)向生長發(fā)育方式的機制仍不清楚。本課題組在前期蛋白組學研究的數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn),與正常大腸黏膜組織、隆起型腺瘤及大腸癌組織相比,橋粒膠糖蛋白家族成員Desmoglein2 (DSG2)、Plakophilin3b (PKP3)、Junction Plakoglobin(JUP)在結(jié)直腸LSTs中的蛋白表達水平均顯著上調(diào)。提示橋粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP可能在結(jié)直腸LSTs的生長發(fā)育過程中扮演著重要的作用。橋粒主要由兩類蛋白質(zhì)構(gòu)成：一類是跨膜蛋白,為鈣粘著蛋白家族成員,主要包括橋粒芯糖蛋白(Desmoglein, DSG)與橋粒芯膠粘蛋白(Desmocollin, DSC),分別構(gòu)成橋粒的細胞間接觸層和電子致密層；另一類為細胞胞漿內(nèi)的橋粒斑,主要由橋粒斑蛋白(Desmoplakin, DP).橋粒斑珠蛋白(Plakoglobin, PG)和橋粒斑菲素蛋白(Plakophilins, PP)構(gòu)成,橋粒斑一端結(jié)合橋粒跨膜蛋白,另一端附著胞漿內(nèi)中間絲(Intermediate Filaments, IF)。DSG2主要分布于表皮內(nèi)中的基底細胞層、心肌及腸道等組織上皮,為“單層上皮型”。橋粒鈣粘素DSG2具有經(jīng)典鈣粘素(E-cadherin)類似的功能,參與正常上皮細胞間粘附的調(diào)控。大量臨床報道許多疾病伴隨著橋粒鈣粘素的異常表達,然而有關(guān)其異常表達的具體機制仍不清楚。文獻報道橋粒鈣粘素異常會導致橋粒連接功能異常,進而影響相應組織的結(jié)構(gòu)以及功能完整性。在細胞內(nèi)PKP3、JUP分別與DSG, DSC的胞內(nèi)功能區(qū)結(jié)合,參與調(diào)節(jié)細胞間粘著及結(jié)合細胞骨架的功能,并對IF附著在橋粒起決定性作用。目的：利用蛋白組學技術(shù)初步探討結(jié)直腸側(cè)向發(fā)育型腫瘤的側(cè)向發(fā)育生長機制。方法：通過透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)研究結(jié)直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織的超微結(jié)構(gòu),觀察三者細胞間的連接方式,看是否找到與結(jié)直腸LSTs側(cè)向生長發(fā)育相關(guān)的異常結(jié)構(gòu)。應用western blot、免疫組化的方法驗證橋粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP在結(jié)直腸LSTs,隆起型腺瘤及正常大腸組織中的表達。組間比較采用單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法(滿足方差齊性時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett's T3法),P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：透射電子顯微鏡(TEM)研究結(jié)直腸LSTs.隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)橋粒數(shù)量及密度在基底層、中間層表達正常,但在上皮側(cè),結(jié)直腸LSTs橋粒的數(shù)量及密度較隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織顯著升高(P值分別為0.000,0.000),而且結(jié)直腸LSTs上皮側(cè)橋粒的數(shù)量及密度最高。用Western blot、免疫組化的實驗方法證實DSG2、PKP3及JUP的蛋白表達量在結(jié)直腸LSTs及隆起型腺瘤中較正常大腸黏膜組織顯著升高(P值分別為0.000,0.000),且在結(jié)直腸LSTs中表達量最高。結(jié)論：DSG2、PKP3及JUP作為橋粒的重要組成部分,三者在結(jié)直腸LSTs的過表達證實了上皮側(cè)橋粒數(shù)量及密度的增加可能導致結(jié)直腸LSTs側(cè)向發(fā)育的生長方式。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【圖文】：

該圖顯示了邋ｉＴＲＡＱ定量技術(shù)的基本原理及主要步驟，ｉＴＲＡＱ定量方法可Ｗ逡逑在一次串聯(lián)質(zhì)譜實驗中同時比較８個樣品中的蛋白的相對含量，主要步驟如圖逡逑中所示，分別為蛋白提取、酶解、標記、混合、ＳＣＸ預分離、液相串聯(lián)質(zhì)譜分逡逑析。在一級質(zhì)譜時，平衡基團可Ｗ確保無論用哪種報告離子標記膚段，都顯示逡逑

圖１－５蛋白質(zhì)定量標準曲線逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ逡逑２N２實驗檢測的樣品蛋白質(zhì)含量，統(tǒng)計信息如下：逡逑

－０－０５邋？邐０．０５邐０．１邐０．１５邐０．２逡逑ＢＳＡ（ｕｇ／ｕｌ）逡逑圖１－５蛋白質(zhì)定量標準曲線逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ逡逑２N２實驗檢測的樣品蛋白質(zhì)含量，統(tǒng)計信息如下：逡逑表１－２樣品蛋白質(zhì)ｆ胃息逡逑Ｔａｂｌｅ．邋１－２邋Ｓａｍｐｌｅ邋Ｉｎｆｂｒｍａｔｉｏｎ（ｎ二２０）逡逑Ｓａｍｐｌｅ邋ＩＤ邐Ｓａｍｐｌｅ邋Ｎａｍｅ邐Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（｜ａｇ／｜ａｌ）邋Ｖ

本文編號：2747084