發(fā)布時間：2020-07-09 06:32

【摘要】：第一部分 結直腸側向發(fā)育型腫瘤分子標志物的篩查背景：大腸癌(Colorectal cancer, CRC)是當前全球范圍內常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率都處于惡性腫瘤前列。由于人們生活方式及飲食機構的西方化,我國結直腸癌發(fā)病率和死亡率亦逐年增加。結直腸側向發(fā)育型腫瘤(laterally spreading tumors, LSTs)為直徑≥10mm的結直腸平坦型腫瘤性病變,是結直腸癌的重要癌前病變,其起病隱匿,早期常無明顯的臨床癥狀,多在常規(guī)結腸鏡檢查時發(fā)現。LSTs在早期大腸癌中約占6%,我科研究發(fā)現LSTs常規(guī)結腸鏡檢出率為0.8%,癌變率占11.5%,故此病在我國發(fā)病率并不低。LSTs因其呈側向和沿腸壁環(huán)周生長,且其進展為黏膜下浸潤癌的機率小于近似大小的隆起型病變,故LSTs更適合于內鏡下切除治療。但LSTs術后復發(fā)率較高,易導致LSTs復發(fā)甚至癌變。蛋白質組學應用于臨床疾病如腫瘤的研究,主要是鑒定機體在正常生理狀態(tài)與異常疾病狀態(tài)下的蛋白質表達水平,并對這些不同狀態(tài)下差異表達的蛋白質進行定量分析。定量蛋白質組(quantitative proteomics)是從蛋白質組學水平上對基因表達進行準確的定量分析,是比較蛋白質組學的核心研究內容,目前廣泛應用于疾病發(fā)病機制以及藥理調控機制等研究。同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)是由美國ABI應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Incorporation, ABI, USA)2004年研發(fā)的新的體外同位素標記技術。其主要流程是蛋白酶切后形成多肽,用iTRAQ同位素試劑標記多肽N末端或賴氨酸側鏈基團。標記后的肽段經過液相分離,進行一級質譜和二級質譜分析,在二級質譜前,被標記的不同樣本中的同一肽段表現為相同的質荷比和其他理化性質。而在二級質譜中,信號離子表現為不同質荷比(114-121)的峰,根據波峰的高度及面積,可以鑒定出蛋白質和分析出同一蛋白質不同處理的定量信息。iTRAQ與傳統(tǒng)的雙向電泳定量分析相比具有以下技術優(yōu)勢：1、標簽種類多,可同時對8個樣本進行分析；2、體外標記,適用于所有生物樣本；3、靈敏度高,檢測限低,可檢測出低豐度蛋白；4、分離能力強,分析范圍廣,iTRAQ可以對任何類型的蛋白質進行分離鑒定,包括高分子量蛋白質、酸性蛋白和堿性蛋白,膜蛋白和不溶性蛋白；5、結果可靠：定性與定量分析結果更加可靠；6、自動化程度高：液相與質譜連用,自動化操作,分析速度快,分離效果好。但iTRAQ技術對檢測標本的蛋白含量要求較高：蛋白總量不少于50ug,蛋白濃度最低不少于5ug/uL,否則同位素無法標記。因iTRAQ操作過程更簡單,定性、定量同時進行,實驗結果可靠且重復性好,相對其他蛋白定量技術優(yōu)勢明顯,故其為目前主流的蛋白質定量技術。目的：通過蛋白質組學技術鑒定并分析出結直腸LSTs特異性表達的蛋白質,以期找到導致其側向生長發(fā)育的可能的分子機制；同時探知與其病情進展相關的蛋白質標記物,提高結直腸LSTs的早期診斷率、療效以及改善預后。方法：隨機收取結直腸LSTs大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉(dlcm)、大腸癌及正常對照組大腸組織標本,每組各20例。分別從各組織樣品中提取蛋白,加入胰酶消化,酶解后的多肽用同位素相對與絕對定量(iTRAQ)試劑進行標記,混合標記后的肽段,用強陽離子交換柱(SCX)和反相色譜柱(RPLC)進行二維分離,然后經基于QE的液質聯(lián)用進行液相串聯(lián)質譜分析并進行蛋白質定量鑒定,通過Mascot數據庫進行檢索得到結直腸LSTs患者的差異蛋白質譜,并對其進行標準生物信息分析。結果：本研究通過同位素相對絕對定量(iTRAQ)技術聯(lián)合多維固／液相色譜與串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)研究策略,共鑒定到4955個蛋白,22587個肽段,其中含21095個Unique肽段。經過比對分析,共有2001個蛋白被鑒定為差異表達蛋白,其中上調蛋白數量分別為：結直腸LSTs組/正常對照組361,結直腸LSTs組/隆起型腺瘤組189,結直腸LSTs組/扁平腺瘤組151,結直腸LSTs組/大腸癌組325；下調蛋白數量分別為：結直腸LSTs組/正常對照組318,結直腸LSTs組/隆起型腺瘤組201,結直腸LSTs組/扁平腺瘤組153,結直腸LSTs組/大腸癌組303；總差異蛋白數量分別為：結直腸LSTs組/正常對照組679,結直腸LSTs組/隆起型腺瘤組390,結直腸LSTs組/扁平腺瘤組304,結直腸LSTs組/大腸癌組628。(注：當蛋白豐度差異倍數達到1.2倍以上,且經統(tǒng)計檢驗其P值小于0.05時,視為差異蛋白。)進一步統(tǒng)計分析發(fā)現,結直腸LSTs存在著特異性表達的蛋白質,即結直腸LSTs與大腸隆起型腺瘤性息肉、大腸小的扁平腺瘤型息肉、大腸癌組織及正常大腸粘膜組織相比,均存在著相同的差異性表達的蛋白質共55個：共同上調的差異蛋白質14個,共同下調的差異蛋白質41個。根據GO功能注釋分析,被鑒定出的結直腸LSTs差異表達的蛋白質中,具有結合功能的差異蛋白所占比例為49.54%,其次是具有酶催化活性作用的蛋白占28.39%,具有酶調節(jié)活性功能的差異蛋白占4.51%,其余差異表達的蛋白質涉及免疫防御反應、血管新生等功能。而被鑒定出的結直腸LSTs55個差異表達的蛋白質中以具有結合功能和運輸代謝功能的蛋白質為主。結論：通過iTRAQ定量蛋白質組學技術,我們成功地鑒定出了結直腸LSTs差異表達的蛋白質譜,并篩選出一批結直腸LSTs特異性表達的蛋白質,其中多種蛋白質具有結合功能、酶調節(jié)活性功能和運輸代謝等功能,提示結直腸LSTs差異表達的蛋白質參與的細胞代謝過程與功能通路在其病程進展過程中發(fā)揮了重要的作用。第二部分結直腸側向發(fā)育型腫瘤分子標志物的驗證與臨床評價背景：結直腸側向發(fā)育型腫瘤(LSTs)患者包括其早期患者的診斷目前還沒有特異性好、敏感度高的標志物。對于結直腸LSTs發(fā)生、發(fā)展機制的研究,尤其是在分子水平的研究證實其由腺瘤轉化為癌的過程中伴隨著許多蛋白質種類和數量的改變,而其中涉及結直腸LSTs分化調控的特異性表達的蛋白質可能會成為具有結直腸LSTs特征性的、并具有較高診斷價值的分子標志物及潛在的治療靶點。利用Western blot、血清ELISA和免疫組織化學方法可以對蛋白質進行定量、定位研究,對疾病的診斷及預后方面具有重要意義。目的：對與結直腸LSTs特異性表達的蛋白質進行鑒定及驗證。方法：隨機收取LSTs及正常對照組血清標本,每組各30例。應用RT-PCR的方法對結直腸LSTs組、隆起型腺瘤組、扁平腺瘤組、大腸癌組及正常對照組大腸組織中差異表達的蛋白質進行mRNA水平的驗證。應用westernblot的方法驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結直腸LSTs、隆起型腺瘤、扁平腺瘤、大腸癌及正常大腸組織中的表達。采用ELISA雙抗夾心法和免疫組織化學驗證LCN-2、MMP-9蛋白在結直腸LSTs及正常大腸組織中的表達水平。組間比較采用獨立樣本t檢驗(Independent-Samples t Test)或單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法(滿足方差齊性時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett's T3法),Spearman(非雙變量正態(tài)分布資料或者等級資料,相關系數用rs表示)相關系數分析LCN2與MMP9蛋白表達以及免疫組化結果與臨床病理特征的相關性,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果：我們選擇了4個與腫瘤病情進展密切相關但目前在LSTs研究領域報道較少的蛋白即LCN-2、SORD、RAB25. CPA3先進行Real Time PCR實驗。結果發(fā)現與正常對照組相比,結直腸LSTs組中LCN-2、SORD、RAB25 mRNA表達顯著升高(P值分別為0.000,0.000,0.043), CPA3 mRNA表達顯著下降(P=0.000),其中LCN-2 mRNA在5組組織中差異表達的趨勢與蛋白組學結果最為一致。隨后對LCN-2及與其功能密切相關的且在LSTs組織中顯著上調的MMP9蛋白進行Western blot、免疫組化驗證,發(fā)現LCN-2、MMP9在結直腸LSTs組織中的表達較正常組顯著升高(P值分別為0.000,0.000)；且二者在組化中的表達強度相關分析結果表明：MMP-9蛋白表達與LCN-2蛋白表達存在正相關關系(rs=0.631,P=0.000)；且LCN-2、MMP-9蛋白表達均與病理分級存在正相關關系(相關系數分別為rs=0.943, P=0.000; rs=0.684, P=0.000)。結直腸LSTs患者血清LCN-2、MMP-9蛋白濃度均顯著高于正常對照組(P值分別為0.000,0.000)；MMP-9蛋白表達與LCN-2蛋白表達存在正相關關系(rs=0.815,P=0.000)；且LCN-2、MMP-9蛋白表達均與病理分級存在正相關關系(相關系數分別為rs=0.927, P=0.000; rs=0.924, P=0.000)。結論：經質譜分析篩選出來的差異蛋白中,LCN-2和MMP-9在結直腸LSTs患者腫瘤組織及血清中的表達水平均顯著增高,且LCN-2在LSTs組織中的表達與其病理分級程度呈正相關,提示LCN-2和MMP-9可能與LSTs病情發(fā)展密切相關,為結直腸LSTs病情進展及分子標志物的研究提供了新的實驗依據。LCN-2蛋白對于提高結直腸LSTs早期診斷率及改善預后具有較大的臨床應用價值,可能成為預測結直腸LSTs診斷、預后監(jiān)測和防治的重要指標。第三部分結直腸側向發(fā)育型腫瘤生長機制的初步探討背景：結直腸LSTs是一種特殊形態(tài)的平坦型大腸腺瘤,其具有以下特點：病變直徑≥10mm；生長方式為沿腸腔側向擴展或環(huán)周生長而非垂直向下生長；依據其表面形態(tài)特征分為顆粒型及非顆粒型。結直腸LSTs是進展期結直腸癌的重要癌前病變,病理以管狀絨毛腺瘤或管狀腺瘤為主。與隆起型腫瘤相比,結直腸LSTs有較高的凋亡指數和較低的增生指數。這樣特殊的細胞凋亡和細胞增生的動力學賦予結直腸LSTs獨特的表面特征,側向發(fā)育的生長方式、惡變后黏膜下浸潤發(fā)生率低和相對低惡性潛能。但既往的分子生物學研究主要集中于結直腸LSTs甲基化的研究,關于其側向生長發(fā)育方式的機制仍不清楚。本課題組在前期蛋白組學研究的數據分析中發(fā)現,與正常大腸黏膜組織、隆起型腺瘤及大腸癌組織相比,橋粒膠糖蛋白家族成員Desmoglein2 (DSG2)、Plakophilin3b (PKP3)、Junction Plakoglobin(JUP)在結直腸LSTs中的蛋白表達水平均顯著上調。提示橋粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP可能在結直腸LSTs的生長發(fā)育過程中扮演著重要的作用。橋粒主要由兩類蛋白質構成：一類是跨膜蛋白,為鈣粘著蛋白家族成員,主要包括橋粒芯糖蛋白(Desmoglein, DSG)與橋粒芯膠粘蛋白(Desmocollin, DSC),分別構成橋粒的細胞間接觸層和電子致密層；另一類為細胞胞漿內的橋粒斑,主要由橋粒斑蛋白(Desmoplakin, DP).橋粒斑珠蛋白(Plakoglobin, PG)和橋粒斑菲素蛋白(Plakophilins, PP)構成,橋粒斑一端結合橋�？缒さ鞍�,另一端附著胞漿內中間絲(Intermediate Filaments, IF)。DSG2主要分布于表皮內中的基底細胞層、心肌及腸道等組織上皮,為“單層上皮型”。橋粒鈣粘素DSG2具有經典鈣粘素(E-cadherin)類似的功能,參與正常上皮細胞間粘附的調控。大量臨床報道許多疾病伴隨著橋粒鈣粘素的異常表達,然而有關其異常表達的具體機制仍不清楚。文獻報道橋粒鈣粘素異常會導致橋粒連接功能異常,進而影響相應組織的結構以及功能完整性。在細胞內PKP3、JUP分別與DSG, DSC的胞內功能區(qū)結合,參與調節(jié)細胞間粘著及結合細胞骨架的功能,并對IF附著在橋粒起決定性作用。目的：利用蛋白組學技術初步探討結直腸側向發(fā)育型腫瘤的側向發(fā)育生長機制。方法：通過透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)研究結直腸LSTs、隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織的超微結構,觀察三者細胞間的連接方式,看是否找到與結直腸LSTs側向生長發(fā)育相關的異常結構。應用western blot、免疫組化的方法驗證橋粒家族蛋白DSG2、PKP3、JUP在結直腸LSTs,隆起型腺瘤及正常大腸組織中的表達。組間比較采用單向方差分析(One-way ANOVA)及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法(滿足方差齊性時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett's T3法),P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果：透射電子顯微鏡(TEM)研究結直腸LSTs.隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織的超微結構,發(fā)現橋粒數量及密度在基底層、中間層表達正常,但在上皮側,結直腸LSTs橋粒的數量及密度較隆起型腺瘤及正常大腸黏膜組織顯著升高(P值分別為0.000,0.000),而且結直腸LSTs上皮側橋粒的數量及密度最高。用Western blot、免疫組化的實驗方法證實DSG2、PKP3及JUP的蛋白表達量在結直腸LSTs及隆起型腺瘤中較正常大腸黏膜組織顯著升高(P值分別為0.000,0.000),且在結直腸LSTs中表達量最高。結論：DSG2、PKP3及JUP作為橋粒的重要組成部分,三者在結直腸LSTs的過表達證實了上皮側橋粒數量及密度的增加可能導致結直腸LSTs側向發(fā)育的生長方式。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.34
【圖文】：

該圖顯示了邋ｉＴＲＡＱ定量技術的基本原理及主要步驟，ｉＴＲＡＱ定量方法可Ｗ逡逑在一次串聯(lián)質譜實驗中同時比較８個樣品中的蛋白的相對含量，主要步驟如圖逡逑中所示，分別為蛋白提取、酶解、標記、混合、ＳＣＸ預分離、液相串聯(lián)質譜分逡逑析。在一級質譜時，平衡基團可Ｗ確保無論用哪種報告離子標記膚段，都顯示逡逑

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本文編號：2747084