發(fā)布時(shí)間：2020-06-14 10:55

【摘要】：糖與核酸、脂類和蛋白質(zhì)一樣,都是組成細(xì)胞的重要成分。它不僅是細(xì)胞能量的主要來(lái)源,更在生命活動(dòng)的調(diào)控方面起著非常關(guān)鍵的作用。研究發(fā)現(xiàn),糖基化的異常修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。糖基化的修飾主要通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶的催化完成。糖基轉(zhuǎn)移酶的異常表達(dá)在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色,并能夠作為生物標(biāo)記物為腫瘤的干預(yù)治療提供特異性靶點(diǎn)。唾液酸是一種帶有負(fù)電荷的九碳單糖,常位于糖鏈末段,能夠與細(xì)胞膜表面蛋白等結(jié)合,是傳遞生物學(xué)信息的重要分子。唾液�；D(zhuǎn)移酶是一類糖基轉(zhuǎn)移酶,它能夠?qū)⑼僖核嵋驭?,3-或α2,6-兩種方式連接在Gal或Gal NAc上,或以α2,8-的連接方式結(jié)合在蛋白質(zhì)上。根據(jù)轉(zhuǎn)移唾液�；笏鶚�(gòu)成的不同類型的糖苷鍵可將唾液酰基轉(zhuǎn)移酶分為ST3Gal I-VI,ST6Gal I-II,ST6Gal NAc I-VI以及ST8Sia I-VI四類。目前發(fā)現(xiàn)許多腫瘤抗原中均存在唾液酸化修飾,而這其中主要的唾液酸化抗原是SLe A和SLe X,經(jīng)證實(shí)它們?cè)诙喾N惡性腫瘤中均有不同程度的高表達(dá),并與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤,在世界范圍內(nèi)都具有較高的發(fā)病率和死亡率,對(duì)其早期診斷和個(gè)性化治療是治療取得成功的關(guān)鍵,因此尋找一個(gè)有效的診斷及治療靶點(diǎn)仍是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。然而目前,關(guān)于唾液酸化修飾在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制研究尚少。一、目的1.揭示α2,3-唾液酰基轉(zhuǎn)移酶在膀胱尿路上皮癌與正常膀胱尿路上皮中表達(dá)量的差異及其對(duì)膀胱癌病人生存率的影響;2.揭示α2,3-唾液�；D(zhuǎn)移酶對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;3.闡明α2,3-唾液酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制。二、方法1.利用基因芯片對(duì)收集的臨床樣本進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析;Real-time PCR,免疫組化,Western-blot等方法檢測(cè)膀胱癌組織與正常膀胱尿路上皮中糖基轉(zhuǎn)移酶的分布及表達(dá)差異;Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析α2,3-唾液酰基轉(zhuǎn)移酶對(duì)膀胱癌患者生存率的影響。2.利用Real-time PCR分析檢測(cè)唾液酰基轉(zhuǎn)移酶前家族成員在不同膀胱癌細(xì)胞系的表達(dá)水平;Western-blot檢測(cè)ST3Gal4和ST3Gal6在不同膀胱癌細(xì)胞系與正常膀胱尿路上皮細(xì)胞之間的表達(dá)差異;通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、G418和有限稀釋法構(gòu)建篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ST3Gal4和ST3Gal6的5637和T24單克隆細(xì)胞株;Real-time PCR、Western-blot、流式細(xì)胞術(shù)及免疫熒光化學(xué)鑒定ST3Gal4和ST3Gal6在5637和T24細(xì)胞中的表達(dá)情況。3.利用CCK8、平板克隆、流式細(xì)胞術(shù)周期、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell遷移侵襲等實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)α2,3-唾液酰基轉(zhuǎn)移酶對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移及侵襲能力的影響;裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)ST3Gal4和ST3Gal6后膀胱癌細(xì)胞在體內(nèi)成瘤能力的變化。4.通過(guò)Western blot研究α2,3-唾液酰基轉(zhuǎn)移酶影響膀胱癌細(xì)胞惡性表型的分子機(jī)制并通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)相關(guān)分子的表達(dá)與定位。三、結(jié)果1.有多種糖基轉(zhuǎn)移酶在膀胱癌組織中的表達(dá)水平具有差異,其中ST3Gal4和ST3Gal6表達(dá)差異顯著,兩者在膀胱癌組織中的表達(dá)量與正常膀胱尿路上皮相比均有不同程度下調(diào),且其在膀胱癌組織中表達(dá)下調(diào)與患者預(yù)后生存率低相關(guān);2.通過(guò)Western blot、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)及Real-time PCR鑒定,已經(jīng)成功構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ST3Gal4和ST3Gal6的膀胱癌細(xì)胞系。3.分別過(guò)表達(dá)ST3Gal4和ST3Gal6,均可抑制膀胱癌細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)、增殖、遷移及侵襲能力;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示:兩者過(guò)表達(dá)后小鼠成瘤能力下降,腫瘤體積變小。4.ST3Gal4和ST3Gal6過(guò)表達(dá)可抑制MMP2、MMP9、AKT、P-S6K、m TOR及EIF4B等蛋白的表達(dá)水平。四、結(jié)論1.ST3Gal4和ST3Gal6在膀胱癌組織中表達(dá)量較正常膀胱尿路上皮中減少,其表達(dá)下調(diào)與患者腫瘤病理分級(jí)密切相關(guān),低表達(dá)提示膀胱癌患者低生存率。2.ST3Gal4和ST3Gal6介導(dǎo)的α2,3-唾液酸化修飾增加能夠抑制膀胱癌細(xì)胞在體內(nèi)及體外的生長(zhǎng)、增殖、遷移及侵襲能力。3.α2,3-唾液�；D(zhuǎn)移酶對(duì)膀胱癌惡性行為的影響主要通過(guò)PI3K-AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.14
【圖文】：

大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3. 檢測(cè) ST3Gal4 及 ST3Gal6 在膀胱癌組織中蛋白水平的表達(dá)情況為了探究 ST3Gal4 及 ST3Gal6 與膀胱癌病理特征之間的關(guān)系及其對(duì)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的影響，我們通過(guò)免疫組化染色的方法在 107 例膀胱癌臨床樣本檢測(cè)ST3Gal4 及 ST3Gal6 在不同病理分級(jí)的臨床樣本組織中的表達(dá)水平，同時(shí)通過(guò)Western blot 的方法檢測(cè) 9 例膀胱癌組織樣本中 ST3Gal4 及 ST3Gal6 中蛋白水平的表達(dá)情況。如圖 1-3（A）所示，與正常膀胱尿路上皮組織相比，隨著膀胱癌惡性程度的增加，ST3Gal4 及 ST3Gal6 蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。如圖 1-3（B）所示，通過(guò)對(duì) 9 例樣本的組織進(jìn)行 Western blot 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) ST3Gal4 及 ST3Gal6蛋白的表達(dá)量較正常膀胱尿路上皮組織減少，與 RNA 水平的檢測(cè)結(jié)果一致，這一結(jié)果我們還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量重復(fù)驗(yàn)證。

Fig.2-3-1 Identification of recombinant expression vector pcDNA3.1(-)/ST3Gal4.圖 2-3-1 重組表達(dá)載體 pcDNA3.1（-）/ ST3Gal4 的鑒定。-3-2 所示，利用 EcoRI/Hind III 雙酶切和 DNA 測(cè)序鑒定 ST3G性克隆，測(cè)序反應(yīng)由南京巴傲得生物科技有限公司提供并完成結(jié)果完全相符。

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本文編號(hào)：2712676