【摘要】：目的:Mineral dust-induced gene(mdig)能夠抑制A549細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖。本研究的主要目的是探索mdig抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移,及促進(jìn)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。研究方法:研究的第一部分:研究mdig抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中使用慢病毒載體分別構(gòu)建A549細(xì)胞mdig沉默和過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系以及人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)mdig過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)、傳代4次以后,對比×100明場和GFP熒光場,GFP陽性細(xì)胞百分比觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,在×400 GFP熒光場,對比轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的變化。使用western blot方法驗(yàn)證mdig蛋白的沉默和過表達(dá)結(jié)果。利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測各A549實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力,Transwell小室和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各A549實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。然后再利用western blot方法分別檢測GSK-3β/β-catenin信號通路的主要生化指標(biāo)(P-GSK-3β、β-catenin、activeβ-catenin)和其下游調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子(slug、snail、ZEB1)的蛋白修飾水平和表達(dá)量的變化,以及EMT的分子標(biāo)志物(E-cadherin、claudin-1、ZO-1、N-cadherin、vimentin)以及細(xì)胞和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的緊密連接蛋白(integrinβ1、integrinβ4)表達(dá)量的變化。研究的第二部分:研究mdig促進(jìn)細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中使用慢病毒載體分別構(gòu)建A549細(xì)胞mdig沉默和過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系以及HUVEC細(xì)胞mdig過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,并使用特異性的PI3K信號通路抑制劑(LY294002)處理A549細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞mdig過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用EdU熒光成像法檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的EdU陽性細(xì)胞百分比,即各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力。再利用western blot方法分別檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PI3K/Akt(P-pten、P-PDK1、Akt、P-Akt(Thr308))和mTORC2/Akt(mTOR、Rictor、GβL、Akt、P-Akt(Ser473))信號通路主要生化指標(biāo)和其下游調(diào)控的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(P~(18INK4C)、P~(19INK4D)、CDK2、CDK6)的蛋白修飾水平和表達(dá)量變化。結(jié)果:成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系:使用相應(yīng)的慢病毒感染A549細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)傳4代后,使用倒置熒光顯微鏡分別在明場×100,和同一個(gè)視野GFP熒光場×100、×400拍照觀察,可見被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞狀態(tài)良好,轉(zhuǎn)染效率高。在A549細(xì)胞mdig沉默實(shí)驗(yàn)中,與LV-con組比較,可見LV-mdig-RNAi 1組和LV-mdig-RNAi 2組mdig蛋白表達(dá)量較正常A549組和LV-con組明顯下降。而在A549細(xì)胞mdig過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,可見LV-mdig組的mdig蛋白表達(dá)量較正常A549組和vector組明顯上調(diào)。HUVEC細(xì)胞mdig過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中,可見LV-mdig組的mdig蛋白表達(dá)量較正常HUVEC組和vector組明顯上調(diào)。Mdig對于細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控:mdig沉默A549細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)由A549細(xì)胞典型的鵝卵狀向類成纖維細(xì)胞的細(xì)長主軸形狀改變,而mdig過表達(dá)A549細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)由鵝卵狀向類圓形改變。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常A549組和對照組比較,mdig過表達(dá)A549細(xì)胞組的穿基質(zhì)膠膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,而mdig沉默A549細(xì)胞組的穿基質(zhì)膠膜細(xì)胞數(shù)卻明顯增加;遷移實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果完全一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證mdig對A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的影響,本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組比較,mdig過表達(dá)A549細(xì)胞組劃痕愈合速度明顯減慢,而mdig沉默A549細(xì)胞組劃痕愈合速度明顯增快。Western blot方法分別檢測GSK-3β/β-catenin信號通路主要生化指標(biāo)和其下游調(diào)控EMT轉(zhuǎn)錄因子的蛋白修飾水平和表達(dá)量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)mdig能夠抑制GSK-3β(P-Ser9-GSK-3β)的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)β-catenin(P-Ser33,Ser37,and Thr41-β-catenin)的磷酸化,使得活化形式的β-catenin(非磷酸化形式)減少,細(xì)胞核內(nèi)移的β-catenin減少導(dǎo)致其下游EMT發(fā)生的直接促進(jìn)因子slug、snail、ZEB1的表達(dá)量降低。而且mdig能夠上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物(E-cadherin、claudin-1、ZO-1)以及細(xì)胞與細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間緊密連接的蛋白(integrinβ1、integrinβ4)的表達(dá),同時(shí)下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(N-cadherin、vimentin)的表達(dá)。在A549細(xì)胞中過表達(dá)mdig能夠抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,沉默mdig時(shí)其侵襲和轉(zhuǎn)移的能力得到了提高,同時(shí)發(fā)現(xiàn)mdig下調(diào)A549細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制主要是通過抑制GSK-3β(P-Ser9-GSK-3β)的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)β-catenin(P-Ser33,Ser37,and Thr41-β-catenin)的磷酸化,使得β-catenin處于不穩(wěn)定狀態(tài),阻止β-catenin細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移,進(jìn)而導(dǎo)致其下游的轉(zhuǎn)錄因子slug、snail、ZEB1表達(dá)下調(diào),從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)志物及促進(jìn)細(xì)胞間緊密連接的蛋白分子E-cadherin、claudin-1、ZO-1、integrinβ1、integrinβ4表達(dá)升高,間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物N-cadherin、vimentin表達(dá)降低。實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用了HUVEC細(xì)胞對上述分子機(jī)制做了驗(yàn)證,并得到了相同的結(jié)果。Mdig對于細(xì)胞增殖的調(diào)控:使用EdU熒光成像法分別檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示:與正常A549細(xì)胞組和對照組比較,mdig過表達(dá)A549細(xì)胞組的EdU陽性細(xì)胞百分比明顯升高,而mdig沉默A549細(xì)胞組的EdU陽性細(xì)胞百分比卻明顯降低,實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用了HUVEC細(xì)胞做了驗(yàn)證,并得到了相同的結(jié)果。Western blot方法分別檢測PI3K/Akt和mTORC2/Akt信號通路主要生化指標(biāo)和其下游調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的蛋白修飾水平和表達(dá)量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):mdig能夠通過促進(jìn)PDK1(Ser241)的磷酸化進(jìn)而促進(jìn)Akt(Thr308)的磷酸化,激活A(yù)kt蛋白進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶CDK2和CDK6的表達(dá),抑制細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑P~(18INK4C)和P~(19INK4D)的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖。同時(shí)這部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示mdig能夠促進(jìn)Akt(Ser473)的磷酸化,其分子機(jī)制主要是通過促進(jìn)mTORC2復(fù)合體的形成,mdig雖然不能夠直接調(diào)控mTOR蛋白的表達(dá)量變化,但是mdig能夠促進(jìn)mTORC2復(fù)合體(mTOR+GβL+Rictor)中GβL和Rictor的表達(dá)來促進(jìn)Akt(Ser473)的磷酸化,激活A(yù)kt蛋白,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶CDK2和CDK6的表達(dá),抑制細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑P~(18INK4C)和P~(19INK4D)的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)論:1.Mdig通過抑制GSK-3β(Ser9)的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)β-catenin(P-Ser33,Ser37,and Thr41-β-catenin)的磷酸化,進(jìn)一步抑制下游EMT發(fā)生的直接促進(jìn)因子slug、snail、ZEB1表達(dá),進(jìn)而抑制A549細(xì)胞EMT的發(fā)生,從而抑制A549細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.Mdig分別通過PDK1和mTORC2促進(jìn)Akt(Thr308,Ser473)的磷酸激活,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶CDK2和CDK6的表達(dá),抑制細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑P~(18INK4C)和P~(19INK4D)的表達(dá)來促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2
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本文編號：
2704289
