【摘要】：一、研究背景:胃癌是我國最常見的消化道腫瘤之一。2008年胃癌發(fā)病率居全球第4位,死亡率居第2位。其中,復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要原因[1,2]。所以,探討胃癌復(fù)發(fā)和遷移侵襲能力增加的分子生物學(xué)機(jī)制,對(duì)胃癌的診斷治療和預(yù)防至關(guān)重要。miR-28與人類的多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-19]。而miR-28-3P與腫瘤的相關(guān)性,文獻(xiàn)報(bào)道很少,生物信息學(xué)分析顯示,PTEN可能是miR-28-3P的靶基因,它可以阻止PI3K的活化,進(jìn)而抑制AKT的磷酸化來達(dá)到阻斷腫瘤細(xì)胞失控性增殖的目的[20]。目前,miR-28-3P與胃癌的關(guān)系并不清楚,miR-28-3P與PTEN及PI3K/AKT通路之間的關(guān)系,也不清楚,如果本研究明確miR-28-3P在胃癌中的作用及機(jī)制,將為胃癌的靶向治療提供重要的理論基礎(chǔ)和新的治療靶點(diǎn)。二、研究目的通過探討miR-28-3P與胃癌的臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系以及它在胃癌的增殖、遷移侵襲中的主要作用及機(jī)制,為胃癌的早期診斷和治療提供重要的理論基礎(chǔ)。三、研究方法1.采用Q-RT-PCR和western blot的實(shí)驗(yàn)方法檢測胃癌患者miR-28-3P的表達(dá)情況;2.shmiR-28-3P慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系,進(jìn)行CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),平板克隆實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等,體外檢測miR-28-3P對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。3.裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)體內(nèi)檢測miR-28-3P對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡以及皮下成瘤能力的影響,并進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)和HE來驗(yàn)證細(xì)胞惡性行為的變化及移植瘤血管生成情況。4.熒光素酶報(bào)告和生物信息學(xué)分析及功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)來探討miR-28-3P在胃癌細(xì)胞中的具體的作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.miR-28-3P在胃癌組織及細(xì)胞系中呈高表達(dá)狀況;2.shmiR-28-3P慢病毒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后,細(xì)胞的增值能力下降,抑凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)量下降,凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)量增加;胃癌細(xì)胞的遷移侵襲能力和劃痕愈合能力明顯下降,與遷移侵襲相關(guān)的蛋白MMP的表達(dá)也明顯下降;3.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明抑制了 miR-28-3P以后,胃癌細(xì)胞的裸鼠成瘤能力下降,移植瘤體積縮小;組織的異型性下降,和腫瘤微血管形成明顯相關(guān)的基因CD31在免疫組化中呈現(xiàn)出低表達(dá);4.抑制miR-28-3P的表達(dá)后,熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)及功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示PTEN基因是miR-28-3P下游作用的靶基因;抑制miR-28-3P的表達(dá)后,胃癌細(xì)胞株中PI3K/AKT呈現(xiàn)低表達(dá)的現(xiàn)象,證明了 miR-28-3P可能是通過抑制PTEN來激活PI3K/AKT通路,促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的。五、結(jié)論miR-28-3P在胃癌組織和多種胃癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)高水平表達(dá)。miR-28-3P的高表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移侵襲及惡性轉(zhuǎn)化。抑制胃癌細(xì)胞株中miR-28-3P的表達(dá),可以促進(jìn)其靶基因PTEN的表達(dá),抑制PI3K/AKT通路的激活,從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。而這一作用可能是通過調(diào)節(jié)miR-28-3P—PTEN—PI3K/AKT通路來實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

轉(zhuǎn)染細(xì)胞在培養(yǎng)箱中溫育６小時(shí)。吸棄轉(zhuǎn)染液，用Ｄ－Ｈａｎｋ’ｓ邋Ｓｏｌｕｔｉｏｎ漂洗逡逑后，轉(zhuǎn)染ＮＣ－ＦＡＭ的細(xì)胞加入１５０４培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果。逡逑由圖２．２可見：隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加轉(zhuǎn)染效率也是逐漸增加的。但是１０ｐｍｏｌ的慢逡逑病毒和２０ｐｍｏｌ的慢病毒之間的轉(zhuǎn)染效率差異不是很顯著，所以我們選定１０ｐｍｏｌ逡逑的濃度作為轉(zhuǎn)染濃度。在熒光顯微鏡下，，我們觀察到感染陽性的細(xì)胞達(dá)（５６±３．２）逡逑％。逡逑３８逡逑

２．３轉(zhuǎn)染效率的ＰＣＲ－ＲＮＡ驗(yàn)證逡逑運(yùn)用ＰＣＲ技術(shù)驗(yàn)證ｓｈｍｉＲ－２８－３Ｐ干擾序列慢病毒下調(diào)ｍｉＲ－２８－３Ｐ的表達(dá)情逡逑況（如圖２．３），結(jié)果顯示，ｍｉＲ－２８－３Ｐ在經(jīng)過慢病毒的轉(zhuǎn)染以后，確實(shí)出現(xiàn)了明逡逑顯的下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑３９逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2650540