【摘要】：背景:胰腺癌惡性程度高且預(yù)后極差,盡管根治性手術(shù)是最有效的治療方式,但是由于確診時多數(shù)胰腺癌患者已伴隨遠處轉(zhuǎn)移或局部侵犯,因此手術(shù)可切除率低。盡管腫瘤生物學在近年獲得了極大的進展,但是胰腺癌轉(zhuǎn)移的具體機制尚不明確,因此深入分析胰腺癌發(fā)生發(fā)展的病理特點,并進行相關(guān)的分子機制研究以研發(fā)新的診療手段是目前胰腺癌基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化研究的當務(wù)之急。胸苷酸合成酶是一種基礎(chǔ)代謝酶,在細胞生長增殖過程中起重要作用�？剐剀账岷铣擅覆呗砸呀�(jīng)成為一種有效的癌癥治療手段。然而,胸苷酸合成酶對胰腺癌的真正影響仍存在爭議。很多研究稱TS高表達與癌癥不良預(yù)后相關(guān),如大腸癌、肺癌、胰腺癌等,但是也有研究提出相反的觀點認為TS高表達的胰腺癌患者預(yù)后更好。為了進一步揭示TS與胰腺癌的關(guān)系,我們系統(tǒng)地評估了胸苷酸合成酶在胰腺癌預(yù)后中的價值以及胸苷酸合成酶是否與胰腺癌的轉(zhuǎn)移進展相關(guān)。在本項研究中,我們首次將胰腺癌組織樣本胞漿和胞核中胸苷酸合成酶的表達分別進行獨立的臨床意義評估。在發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞核中TS高表達與淋巴轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后相關(guān)的基礎(chǔ)上,我們進一步利用體外實驗探索了胸苷酸合成酶對胰腺癌細胞系生物學行為影響,并最終利用兩種胰腺癌轉(zhuǎn)移模型驗證了胸苷酸合成酶和胰腺癌轉(zhuǎn)移侵襲能力的相關(guān)性。方法:從2007年1月至2016年1月間,隨機收集91例胰腺癌組織樣本(其中71例蠟塊包埋組織樣本,20例新鮮冰凍樣本)及其相對應(yīng)的正常胰腺組織。整理樣本臨床資料,利用定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,q-PCR)分析新鮮冰凍胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中TS的表達差異;利用免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)染色法對石蠟包埋的胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中TS的表達進行統(tǒng)計并結(jié)合臨床資料進行臨床意義分析。在體外實驗中,我們使用含人源性shTS序列慢病毒載體轉(zhuǎn)染PANC-1胰腺癌細胞株,建立TS基因short hairpin RNA(shRNA)穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1-shTS。利用cellcounting kit-8(CCK-8)試劑盒每24小時檢測TS對PANC-1細胞生長增殖的影響。利用噻唑藍(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)檢測各種化療藥物對胰腺癌細胞系的影響。此外,我們利用劃痕和Transwell法觀察PANC-1細胞的運動性能。使用western blot法和細胞免疫熒光檢測PANC-1細胞EMT進程中各關(guān)鍵蛋白表達量,為了進一步驗證TS對EMT進程的調(diào)節(jié),我們檢測了 TS缺如對轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)誘導(dǎo)胰腺癌細胞EMT的影響。同時,為了尋找潛在機制,我們使用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法檢測了胰腺癌細胞裂解產(chǎn)物中TS下游代謝產(chǎn)物脫氧胸苷酸(deoxyadenosine triphosphate,dTMP)的含量,并研究 dTMP 對胰腺癌細胞 EMT的影響。此外,在體內(nèi)實驗中我們使用原位胰腺癌裸鼠轉(zhuǎn)移模型和胰腺癌肺循環(huán)轉(zhuǎn)移模型,結(jié)合磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),計算機斷層掃描(computed tomography,CT)和正電子發(fā)射斷層掃描(positron emission tomography,PET)技術(shù)系統(tǒng)評估了 TS對胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響,并利用IHC法分析裸鼠胰腺癌轉(zhuǎn)移瘤中細胞增殖指標Ki-67的表達。結(jié)果:q-PCR結(jié)果顯示在20例新鮮冰凍胰腺癌組織樣本中共有9例出現(xiàn)了 TS基因表達量顯著增高(≥2倍,最高者達到19倍)。同時,western blot結(jié)果表明在公認的具有更高惡性生物學行為的胰腺癌細胞株中,TS的表達量也出現(xiàn)了相應(yīng)增高。IHC分析表明TS廣泛分布于胰腺癌腫瘤細胞和癌旁導(dǎo)管上皮細胞的胞漿與胞核中。雖然胰腺癌腫瘤細胞胞漿中TS表達率(p=0.637)與染色強度(p=0.611)并無顯著增高,但腫瘤細胞胞漿中TS的表達與周圍神經(jīng)侵犯及腫瘤組織學分級密切相關(guān)�？ㄆ仗m-邁耶分析也證實,胞漿中TS表達強度低的胰腺癌患者的總生存率雖稍有改善,但是并不具備統(tǒng)計學意義(p=0.84)。但是胰腺癌腫瘤細胞和癌旁導(dǎo)管上皮細胞的胞核中TS的表達不僅在染色率上有明顯差異,而且癌組織細胞核中TS的表達量與胰腺癌病理分級(p=0.043)和淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(p=0.016)。生存分析則進一步表明腫瘤細胞核中TS的表達與患者總體生存期呈顯著負相關(guān)(p=0.015)。因此,TS是胰腺癌預(yù)后的潛在生物學標記物,而且在胰腺癌惡性進展中發(fā)揮著重要作用。體外細胞學實驗發(fā)現(xiàn),雖然TS對PACN-1細胞的增殖速度并無明顯影響。但TS敲除的胰腺癌細胞對不同濃度吉西他濱(gemcitabine,GEM)的化療敏感性均顯著提升,但是對于5-氟尿嘧淀(5-fluorouracil,5-FU)和厄洛替尼的作用卻無明顯影響。Transwell實驗和劃痕試驗表明TS的低表達能明顯削弱PANC-1細胞的侵襲和遷移能力。Western blot實驗顯示在PANC-1-shTS細胞株中,上皮標志物E-cadherin蛋白表達增加,而EMT進程中涉及的轉(zhuǎn)錄因子,如Snail,Vimentin和ZEB-1表達量均下降。而β-catenin作為EMT中標志性的核轉(zhuǎn)位蛋白,在PANC-1-shTS細胞的胞漿和胞核中表達量均降低。細胞免疫熒光實驗顯示在PANC-1-shTS細胞中,細胞膜上E-cadherin表達增加,細胞漿中β-catenin重新分布,相應(yīng)地,胞漿中Vimentin表達降低。除此之外,westernblot和細胞免疫熒光實驗均表明TGF-β作用后引起的β-catenin核轉(zhuǎn)位增多和Vimentin過表達現(xiàn)象在PANC-1-shTS細胞中均被弱化。HPLC結(jié)果表明在dTMP在PANC-1野生型(wildtype,WT)和 PANC-1-shcontrol 中表達量相近,而在 PANC-1-shTS 細胞中,dTMP含量顯著減少。Western blot實驗顯示,10OμM dTMP作用于胰腺癌細胞株24小時后,E-cadherin幾乎不表達,而相對地,Snail,Vimentin,ZEB-1的表達量均顯著增加,這一現(xiàn)象在PANC-1-shTS細胞中同樣被觀察到。在體內(nèi)實驗小鼠胰腺癌轉(zhuǎn)移模型中,影像學檢測結(jié)果表明,sh-TS實驗組中原位胰腺腫瘤的生長被抑制且肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)量顯著減少,同時生存分析結(jié)果表明低表達TS可顯著改善荷瘤裸鼠的總生存率。在胰腺癌裸鼠肺循環(huán)轉(zhuǎn)移模型中,影像學檢測結(jié)果也同樣證實低表達TS可明顯抑制裸鼠肺臟內(nèi)胰腺癌轉(zhuǎn)移灶的形成。最后,免疫組化分析結(jié)果表明,肝臟和肺臟的轉(zhuǎn)移瘤中,TS敲除能顯著降低Ki-67的表達。結(jié)論:臨床樣本免疫組化分析顯示胰腺癌腫瘤細胞核中TS高表達可能與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān),并提示預(yù)后不良。體外研究顯示PDACs中TS基礎(chǔ)表達量和GEM耐藥程度正相關(guān),而sh-TS可顯著提高GEM對胰腺癌細胞作用的敏感性,并抑制胰腺癌細胞株的侵襲和遷移能力。后續(xù)機制研究提示,TS通過下游產(chǎn)物dTMP影響dNTP池的平衡可能是其調(diào)控胰腺癌EMT相關(guān)侵襲遷移能力的潛在機制。sh-TS不僅同時抑制原位胰腺癌轉(zhuǎn)移動物模型和肺循環(huán)轉(zhuǎn)移動物模型中胰腺癌的遠處轉(zhuǎn)移能力,且可顯著改善荷瘤裸鼠的總生存率。而免疫組化則證實細胞增殖指標Ki-67在sh-TS組轉(zhuǎn)移灶內(nèi)也出現(xiàn)了顯著下調(diào)。
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我們提�。玻袄迈r冰凍胰腺癌及相對應(yīng)的癌旁組織樣本中ＲＮＡ，并進行逡逑ｑ－ＰＣＲ分析，結(jié)果顯示，在部分胰腺癌組織４５％邋（９／２０）中ＴＳ基因的表達量高于逡逑其對應(yīng)癌旁組織２倍以上，差異最大者達到１９倍（圖１．１）。逡逑２２１逡逑ｉ２0－邐？邐？逡逑ｃ邋１８－逡逑？２邋１ｆｉ邋？逡逑８邋１６＿逡逑￡邋１４－逡逑ｘ邋１２－逡逑Ｉ邋１０－邐？逡逑Ｑ）邋８－逡逑＾邋６－邋？邋？逡逑１邋４－邋？逡逑0邋｜卞邋Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣邋丨令卞邋１邋￣￣Ｉ－－１邋Ｉ邋Ｉ邋￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣￣Ｉ邋￣Ｉ邋Ｉ邋１邋，逡逑ｔ－ｃｎｃｏ邋對邐①卜邋000＞0逡逑ＣＭ逡逑圖１．１胰腺癌組織與相對應(yīng)癌旁組織中ＴＳ基因總體表達量差異分析圖逡逑？邐鑒于ｑ－ＰＣＲ分析僅能反應(yīng)ＴＳ在基因水平上的表達情況，而ＴＳ蛋白才是在體逡逑內(nèi)發(fā)揮功能的活性物質(zhì)。因此，我們利用ＩＨＣ染色法進一步分析ＴＳ蛋白在胰腺癌逡逑及癌旁組織中的定位及表達情況。逡逑我們對７１例胰腺癌及癌旁蠟塊組織樣本進行免疫俎化染色，結(jié)果表明，ＴＳ逡逑蛋白在不同分化程度的胰腺癌組織中普遍表達（圖１．１），且廣泛分布于胰腺癌組逡逑織和癌旁組織的細胞漿與細胞核中（圖１．２）。結(jié)合上述ｑ－ＰＣＲ結(jié)果，我們推測逡逑ＴＳ在癌組織和正常組織中均有表達，在細胞增殖過程不可或缺，而ＴＳ的異常表逡逑達可能與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。逡逑９逡逑

正文第？部分結(jié)果逡逑：＇Ｖ媭⑷．：：．．＼：：Ｋ＇：＇逡逑圖１．２邋ＴＳ蛋白（黃褐色顆粒）在胰腺癌組織（Ａ）和癌旁組織（Ｂ）中的染色圖逡逑染色圖可清晰顯示胰腺癌及癌旁組織胞漿和胞核中均有ＴＳ表達（比例尺為５０ｐｍ）逡逑Ａ邋：邋：‘NB邋．邋＇邐＇邋°邐…懰逡逑．＇邋Ａ．＂邐，逡逑圖１．３高分化（Ａ）、中分化（Ｂ）、低分化（Ｃ）胰腺癌組織中逡逑ＴＳ蛋白染色的代表性圖片逡逑１．３．２邋ＴＳ在胰腺癌及癌旁組織細胞漿中的表達及其臨床意義逡逑為進一步揭示ＴＳ與胰腺癌的關(guān)系，我們分別獨立研究細胞漿和細胞核中ＴＳ逡逑的表達及相關(guān)臨床意義。首先我們分析ＴＳ在胰腺癌腫瘤細胞和癌旁導(dǎo)管上皮細胞逡逑漿中的表達差異，再結(jié)合臨床資料分析胰腺癌細胞漿中ＴＳ的表達與臨床病理特征逡逑之間的關(guān)系。逡逑１．３．２．１邋ＴＳ在胰腺癌腫瘤細胞漿和癌旁導(dǎo)管上皮細胞胞漿中的表達差異逡逑我們對７１例蠟塊包埋胰腺癌及癌旁組織的細胞胞漿中ＴＳ蛋白表達情況進行逡逑ＩＨＣ染色分析，結(jié)果顯示在７１例胰腺癌細胞胞漿中ＴＳ的免疫組化染色結(jié)果中，逡逑５９例ＴＳ蛋白表達陽性，１２例表達陰性；在相對應(yīng)的癌旁組織中，６２例ＴＳ蛋白逡逑表達陽性，９例表達陰性，，卡方檢驗分析結(jié)果顯示ｐ值為０．６３７，不具備統(tǒng)計學意逡逑義。表明胰腺癌與癌旁組織細胞漿中ＴＳ的染色率無顯著差異（表１．１）。逡逑１０逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9

【參考文獻】

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本文編號：2634951