【摘要】：研究背景胃癌是世界最常見惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類健康,尤其是晚期胃癌患者,目前仍缺乏有效治療手段可以顯著提高生存時(shí)間。近年來,以放化療為主的傳統(tǒng)療法因復(fù)發(fā)率高、不良反應(yīng)嚴(yán)重等缺點(diǎn)而屢遭詬病,隨著生物學(xué)技術(shù)發(fā)展,具有腫瘤特異性殺傷效果的靶向治療逐漸成為國際研究熱點(diǎn)。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR) T細(xì)胞免疫治療屬于細(xì)胞靶向治療方式之一,即通過病毒等載體將可識別特定抗原的CAR基因轉(zhuǎn)染并表達(dá)于T細(xì)胞,體外擴(kuò)增后回輸入患者體內(nèi)引起特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)。CAR分子主要由胞外抗原結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)四部分組成。為增強(qiáng)CART細(xì)胞增殖活化能力,研究者不斷增加信號傳導(dǎo)區(qū)內(nèi)共刺激分子的數(shù)量,發(fā)展出新一代CART細(xì)胞,大大提高了 T細(xì)胞抗腫瘤能力。該療法具有高特異性和非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)限制性等優(yōu)點(diǎn),并在血液惡性腫瘤的治療中獲得顯著的臨床效果,然而其在實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用中受到很大挑戰(zhàn),主要包括嚴(yán)重不良事件的發(fā)生,腫瘤免疫抑制微環(huán)境,CAR-T細(xì)胞歸巢能力和局部活化能力差等問題。人表皮生長因子受體 2 (human epidermal growth factor receptor 2, HER2)蛋白在胃癌患者中過表達(dá),同時(shí)研究證明其對腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)亞群的生存和功能維持起到重要的作用。鑒于曲妥珠單抗在胃癌治療中的顯著效果,表面抗原HER2可作為CAR T細(xì)胞治療的較理想靶點(diǎn)。研究目的在這項(xiàng)研究中,我們以HER2scFv-CD8-CD137-CD3i;質(zhì)粒為基礎(chǔ),構(gòu)建了一種新穎的HER2特異性CAR分子,經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后,觀察CAR基因修飾T細(xì)胞的表型特征,并評估C A R T細(xì)胞對胃癌細(xì)胞和胃癌干樣細(xì)胞的體內(nèi)和體外殺傷能力。研究方法1、通過慢病毒載體將CAR受體的HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因轉(zhuǎn)染入T細(xì)胞,并利用流式細(xì)胞儀檢測CAR T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和表型特征。2、體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測HER2表達(dá)情況,并通過慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)卡RNA (shRNA)基因沉默技術(shù)敲低胃癌細(xì)胞HER2表達(dá)。3、細(xì)胞因子ELISA法檢測CART-HER2細(xì)胞在體外對胃癌細(xì)胞的特異性活化能力,LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測CART-HER2細(xì)胞在體外對胃癌細(xì)胞的特異性殺傷能力。4、培養(yǎng)原代胃癌細(xì)胞,利用腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)獲得胃癌干樣細(xì)胞,并通過CART細(xì)胞與胃癌細(xì)胞球共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)評估CART細(xì)胞對胃癌干樣細(xì)胞的殺傷能力。5、利用HER2陽性胃癌細(xì)胞和胃癌干樣細(xì)胞建立BALB/C裸鼠胃癌模型。6、通過測量小鼠移植瘤的體積和重量評估CART細(xì)胞體內(nèi)胃癌腫瘤抑制能力。7、通過小鼠外周血和腫瘤內(nèi)C A R基因拷貝量檢測和病理組織免疫組化染色評估C A R T細(xì)胞的體內(nèi)持續(xù)和歸巢能力。研究結(jié)果1、成功將CAR受體的HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因轉(zhuǎn)染入T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率為 34.22% 士 4.00%,體外擴(kuò)增后,CAR T細(xì)胞 CD8+CD56-表型比例為 72.55% ± 7.26%,中央記憶表型 CD45RO+CD62L+CCR7+比例為 23.35% ±7.59%。2、胃癌細(xì)胞系HER2陽性率為84.39%～98.60%,兩株原代胃癌細(xì)胞HER陽性率分別為 56.80%和 2.48%,N87-HER2KD 細(xì)胞和 7901-HER2KD 細(xì)胞 HER2 陽性率分別為 41.01%和 56.00%。3、CART-HER2細(xì)胞與HER2陽性胃癌細(xì)胞共培養(yǎng)后,釋放的白介素2、干擾素-γ、白介素4、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子、腫瘤壞死因子、顆粒酶B等細(xì)胞因子水平顯著高于對照組,對腫瘤細(xì)胞的殺傷效率也明顯優(yōu)于對照組。4、成功培養(yǎng)出胃癌干細(xì)胞球,HER2和CD44陽性率分別為73.5%和98.6%。CART細(xì)胞與胃癌干細(xì)胞球共培養(yǎng)48小時(shí)后,腫瘤球被分解成小片,大量腫瘤干樣細(xì)胞死亡裂解,殺傷效果顯著高于對照組。5、通過皮下注射HER2陽性胃癌細(xì)胞或胃癌干樣細(xì)胞成功建立胃癌BALB/C裸鼠模型。6、CART-HER2細(xì)胞治療組小鼠腫瘤生長速率明顯受到抑制,腫瘤平均體積和平均質(zhì)量顯著低于NT T細(xì)胞治療組。7、治療3周后,小鼠外周血和腫瘤內(nèi)CAR基因平均拷貝量處于高水平狀態(tài),而至少56天內(nèi),小鼠外周血CAR基因拷貝量處于可檢測水平。免疫組化染色提示大量人CD3陽性T細(xì)胞浸潤腫瘤組織,明顯高于對照組。結(jié)論1、攜帶HER2scFv-CD8-CD137-CD3ζ基因的慢病毒成功合成,病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后,CAR蛋白能夠穩(wěn)定表達(dá)于T細(xì)胞表面。2、CART-HER2細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后,細(xì)胞大量增殖,其中絕大部分細(xì)胞為CD8+效應(yīng)T細(xì)胞,同時(shí)中央記憶型T細(xì)胞比例也明顯提高。3、CART-HER2細(xì)胞在體外能夠被HER2陽性胃癌細(xì)胞特異性激活,分泌大量細(xì)胞因子,并能有效地裂解多種HER2陽性的胃癌細(xì)胞以及胃癌患者來源的原代細(xì)胞。4、CART-HER2細(xì)胞可以有效、持續(xù)、靶向定位地抑制HER2陽性胃癌BALB/c裸鼠模型的生長。5、CART-HER2細(xì)胞在體外能夠明顯抑制HER2陽性胃癌干細(xì)胞球的生長,并能有效識別并裂解患者來源的HER2陽性胃癌干樣細(xì)胞。6、HER2陽性胃癌干樣細(xì)胞可以在BALB/c裸鼠皮下成瘤,而CART-HER2細(xì)胞有效抑制了移植瘤在裸鼠體內(nèi)的生長。
【圖文】：

一）人外周血單核細(xì)胞的分離、病毒轉(zhuǎn)染、體外擴(kuò)增以及表型鑒定逡逑我們已在以前的研究中成功構(gòu)建了含ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＣＤ邋１３７－ＣＤ３Ｇ基因的粒（圖１），本實(shí)驗(yàn)使用臨床級復(fù)制缺陷性慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)合成病毒顆粒，時(shí)構(gòu)建了含ＧＦＰ基因的表達(dá)質(zhì)粒來驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，以及不含ｓｃＦｖ的表達(dá)質(zhì)ｏｃｋ對照。逡逑ＨＥＲ２特異性ｓｃＦｖ邐信號域逡逑里邐皇逡逑ＶＬ邋￣Ｕ￣邋ＶＨ邐ＣＤ８ａ邋ｈｉｎｇｅ邋ａｎｄ邋ＴＭ邋ＣＤ１３７邋ＣＤ３Ｌｉｎｋｅｒ逡逑圖邋１：邋ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＣＤ８－ＣＤ１３７－ＣＤ３；邋ＣＡＲ邋基因序列示意圖逡逑１00ｎ邐ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２逡逑

主要為邋ＣＤ８＋ＣＤ５６－細(xì)胞（７２．５５％邋±７．２６％），而中央記憶（ｃｅｎｔｒａｌ邋ｍｅｍｏｒｙ邋Ｔ，Ｔｃｍ）逡逑表型ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋邋Ｔ細(xì)胞比例約為２３．３５％邋±邋７．５９％，顯著高于ＮＴ邋Ｔ細(xì)胞逡逑（圖３和圖５）。ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２邋Ｔ細(xì)胞和Ｍｏｃｋ邋Ｔ細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)染效率分別為３４．２２％邋士逡逑４．００％和３２．９５％邋±４．７６％邋（圖４）。我們選擇來源于其中一名志愿者的生長狀態(tài)最佳的逡逑細(xì)胞組開展后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。逡逑１００邐＿邋ＣＡＲ�。龋牛遥插义稀觯殄澹危藻义希椋礤义希捱姡捱姡錘B逡逑ｃ／邋ｃ／邋ｃ／逡逑圖３：來源于３名志愿者的ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２細(xì)胞和ＮＴＴ細(xì)胞表型特征對比逡逑７５－，逡逑ｂ邋６０－逡逑爸４５－逡逑Ｉ邋３０－邐—＝Ｊ＝—逡逑§邋１５－逡逑ｈ１逡逑０－１邐１邐１邐逡逑ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２邋ｃｅｌｌｓ邋Ｍｏｃｋ邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑圖４：來源于３名志愿者的ＣＡＲＴ－ＨＥＲ２細(xì)胞或ＭｏｃｋＴ細(xì)胞平均轉(zhuǎn)染效率對比逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：2607482