本文關鍵詞：腫瘤血管內(nèi)皮細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞腫瘤歸巢相關性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的分離培養(yǎng)鑒定乳腺癌血管內(nèi)皮細胞及與之配對的正常乳腺組織血管內(nèi)皮細胞,并比較兩者生物學性狀差異 方法(1)取新鮮乳腺癌組織及正常乳腺組織,剪碎,膠原酶消化成單細胞懸液,細胞標記抗CD31單克隆抗體,免疫磁柱分離抗CD31單克隆抗體陽性細胞,即血管內(nèi)皮細胞,并且體外原代培養(yǎng),顯微鏡觀察細胞形態(tài)。(2)流式細胞儀檢測血管內(nèi)皮細胞標志性分子CD31、CD34、CD105及vWF。(3)實時熒光定量技術檢測正常組織血管內(nèi)皮細胞及腫瘤血管內(nèi)皮細胞基因表達差異。(4)體外血管生成模型驗證兩種內(nèi)皮細胞的成管能力。 結(jié)果(1)免疫磁珠可以分離得到的高純度的腫瘤血管內(nèi)皮細胞及正常血管內(nèi)皮細胞,兩者存在形態(tài)學差異。(2)與正常血管內(nèi)皮細胞相比,腫瘤血管內(nèi)皮細胞高表達特異性的分子標志：腫瘤血管內(nèi)皮細胞高表達腫瘤內(nèi)皮標志1(Tumor endothelial markers, TEMs),腫瘤內(nèi)皮標志1(TEM8),內(nèi)皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2),內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)以及乳腺癌血管內(nèi)皮細胞所特有的標志HEYL和PRL-3。(3)腫瘤血管內(nèi)皮細胞具有更強的體外血管形成能力。 結(jié)論免疫磁珠分選技術可以得到高純度的內(nèi)皮細胞,且兩者存在形態(tài)學及生物學性狀差異。 目的間充質(zhì)干細胞是中胚層來源的具有多向分化潛能的干細胞,因其具有低免疫原性,腫瘤靶向歸巢特性,以及其易于分離,擴增,可進行遺傳修飾等優(yōu)點,已成為最理想的基因治療細胞載體。然而,目前研究對間充質(zhì)干細胞腫瘤歸巢的機制缺乏系統(tǒng)性的研究和深入認知。本文旨在探討間充質(zhì)干細胞靶向歸巢與腫瘤血管內(nèi)皮細胞的相關性。 方法(1) Transwell模型驗證腫瘤組織及正常組織對間充質(zhì)干細胞的體外遷移能力。(2)免疫熒光檢測腫瘤組織及正常組織對間充質(zhì)干細胞微管組織中心(MTOC)的影響。(3)膠原酶消化法及胰酶差異消化法獲得腫瘤成纖維細胞,原代腫瘤細胞,Boyden小室比較不同細胞對間充質(zhì)干細胞遷移能力影響。(4)鬼比環(huán)肽染色共培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞,激光共聚焦觀察細胞F-actin改變。 結(jié)果(1)與正常組織相比,腫瘤組織促進間充質(zhì)干細胞的遷移能力更強。(2)間充質(zhì)干細胞微管組織中心(MTOC)向腫瘤組織部位極性化,微管排列不規(guī)則,正常組織組觀察到此現(xiàn)象。(3)來源于腫瘤組織的不同細胞中,腫瘤血管內(nèi)皮細胞對間充質(zhì)干細胞的去化能力更強。(4)與腫瘤血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞極性及細胞骨架發(fā)生明顯變化。 結(jié)論腫瘤血管內(nèi)皮細胞參與了間充質(zhì)干細胞的腫瘤靶向歸巢 目的作為理想的腫瘤基因治療的細胞載體,間充質(zhì)干細胞的腫瘤歸巢是實現(xiàn)靶向治療的關鍵環(huán)節(jié)及重要前提,明確間充質(zhì)干細胞腫瘤歸巢的分子本質(zhì)對于其合理設計和應用腫瘤靶向治療具有理論意義和指導價值。本研究在于從分子水平上探討間充質(zhì)干細胞靶向歸巢的機制。 方法(1)細胞因子芯片高通量篩選參與間充質(zhì)干細胞歸巢的細胞因子。(2)ELISA檢測腫瘤血管內(nèi)皮細胞與間充質(zhì)干細胞不同培養(yǎng)方式的IL6分泌量。(3)MTT方法檢測IL6對細胞生長的影響。(4)Transwell模型驗證IL6對間充質(zhì)干細胞的體外遷移能力的影響。(5)鬼比環(huán)肽染色IL6處理的間充質(zhì)干細胞,激光共聚焦觀察細胞F-actin改變。(6)Western-blot檢驗IL6對間充質(zhì)干細胞信號通路的改變。(7)利用Anti-IL6中和抗體封閉腫瘤內(nèi)皮細胞分泌的IL6后,Transwell模型檢驗其對間充質(zhì)干細胞的遷移能力的影響。(8)SiRNA干擾技術反義封閉腫瘤內(nèi)皮細胞的IL6表達,Transwell模型檢驗其對間充質(zhì)干細胞遷移能力的改變。(9)細胞體外標記并流式細胞儀鑒定標記效率后,利用小鼠耳朵模型體內(nèi)驗證IL6對間充質(zhì)干細胞歸巢的影響。 結(jié)果(1)細胞因子芯片發(fā)現(xiàn)腫瘤血管內(nèi)皮細胞與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)的白介素-6蛋白表達峰度相對于腫瘤血管內(nèi)皮細胞的表達峰度增高3.6倍,相對于間充質(zhì)干細胞的蛋白表達峰度升高8.92倍。(2)ELISA檢測發(fā)現(xiàn),腫瘤血管內(nèi)皮細胞與間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)上清中IL6顯著升高,驗證了細胞因子芯片的結(jié)果。(3)MTT檢驗發(fā)現(xiàn)白介素6并未明顯促進間充質(zhì)干細胞增殖。(4)人重組IL6蛋白處理的間充質(zhì)干細胞的體外遷移能力明顯增強,結(jié)晶紫染色間充質(zhì)干細胞穿膜細胞數(shù)明顯增多,且存在劑量和時間依賴性。(5)激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)：10ng/ml IL6處理的間充質(zhì)干細胞極性及細胞骨架發(fā)生明顯變化,肌動蛋白變粗變大,并出現(xiàn)偽足結(jié)構(gòu)。(6) Western-blot結(jié)果表明人重組IL6蛋白可以導致間充質(zhì)干細胞內(nèi)STAT3磷酸化,并上調(diào)與細胞運動密切相關的蛋白MMP3, MMP9。(7)Anti-IL6中和抗體可以有效的阻礙間充質(zhì)干細胞的穿膜能力。(8) Western-blot結(jié)果表明IL6/SiRNA可有效抑制間充質(zhì)干細胞內(nèi)靶蛋白IL6的表達,抑制STAT3的活化,并且明顯降低了間充質(zhì)干細胞的體外遷移能力。(9)DiO及CellTrackerTM dye對內(nèi)皮細胞及間充質(zhì)干細胞的標記效率分別為96.53±3.21%,98.71±4.67%,且標記時間可長達3周。(10)小鼠耳朵模型從體內(nèi)驗證了IL6為間充質(zhì)干細胞靶向歸巢的重要分子機制。 結(jié)論IL6/STAT3信號通路可能參與了間充質(zhì)干細胞的腫瘤靶向歸巢
【關鍵詞】：內(nèi)皮細胞 分離鑒定 成管 間充質(zhì)干細胞 腫瘤血管內(nèi)皮細胞 遷移 細胞因子芯片 白介素6 細胞遷移
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-13
• 研究背景13-21
• 參考文獻15-21
• 第一部分：乳腺癌相關血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定21-40
• 中文摘要21-22
• Abstract22-23
• 前言23-24
• 材料與方法24-31
• 實驗結(jié)果31-35
• 討論35-36
• 參考文獻36-40
• 第二部分：腫瘤血管內(nèi)皮細胞促進了間充質(zhì)干細胞的體外遷移能力40-57
• 中文摘要40-41
• Abstract41-42
• 前言42-43
• 材料方法43-47
• 實驗結(jié)果47-50
• 討論50-52
• 參考文獻52-57
• 第三部分：細胞因子芯片高通量篩選參與間充質(zhì)干細胞靶向歸巢的分子機制57-84
• 中文摘要57-58
• Abstract58-60
• 前言60-61
• 材料方法61-69
• 實驗結(jié)果69-78
• 討論78-79
• 參考文獻79-84
• 綜述84-108
• 參考文獻98-108
• 致謝108-109

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