本文關(guān)鍵詞：中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis）抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉(zhuǎn)移活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis Walker),俗稱土鱉、土元等,屬于蜚蠊目(Blattodea),鱉蠊科(Corydiidae),地鱉亞科(Polyphaginae),真地鱉屬(Eupolyphaga)昆蟲,目前已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模人工養(yǎng)殖。中華真地鱉作為一種傳統(tǒng)中藥,在我國具有悠久的藥用歷史�，F(xiàn)代研究表明,中華真地鱉具有溶解血栓、抗凝血、抗腫瘤、促進(jìn)骨折愈合、調(diào)節(jié)血脂等十分廣泛的藥理作用。對于中華真地鱉的研究,國外學(xué)者很少涉及,其研究近乎空白。近年來,國內(nèi)學(xué)者研究表明中華真地鱉蛋白提取物能夠抑制血管生成和腫瘤生長。可見,蛋白組分被認(rèn)為是中華真地鱉的抗腫瘤有效組分。但是,到目前為止,尚未見中華真地鱉抗腫瘤蛋白成分的報(bào)導(dǎo)。 我們利用現(xiàn)代生化分離技術(shù),從中華真地鱉新鮮雌蟲體中分離純化得到一分子質(zhì)量約為72kDa的抗腫瘤蛋白,命名為EPS72。該蛋白對人肝癌細(xì)胞株Bel-7402、肺癌細(xì)胞株A549等多種人癌細(xì)胞株表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖抑制作用。以A549細(xì)胞作為體外腫瘤模型,研究了EPS72對細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡、粘附、伸展、遷移以及侵襲的影響,發(fā)現(xiàn)EPS72具有體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性,并初步探討了EPS72體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移可能的分子機(jī)制。期望為EPS72進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的線索,同時為抗腫瘤蛋白類藥物的研究提供一些新的思路。本課題的主要研究內(nèi)容及結(jié)果有以下幾個方面： 1中華真地鱉抗腫瘤蛋白的提取、純化及鑒定 首先采用硫酸銨分級沉淀(50%-80%飽和度)、超濾(截留分子質(zhì)量為10kDa)和冷凍干燥技術(shù)獲得蛋白粗提物(組分Ⅰ)。由組分Ⅰ得到抗腫瘤活性蛋白的純化方案由捕獲、中度純化和精制三個步驟組成：(1)捕獲：分別采用CM-Sepharose FF陽離子交換色譜和DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜對抗腫瘤有效活性組分進(jìn)行捕獲；(2)中度純化：分別采用Q-Sepharose HP陰離子交換色譜和Butyl Sepharose HP疏水色譜進(jìn)行中度純化；(3)精制：采用Superdex75凝膠過濾色譜進(jìn)行精制。整個純化過程中采用280nm檢測蛋白質(zhì)洗脫情況,分別收集各洗脫峰,采用MTT法追蹤抗腫瘤活性組分,最后得到的活性組分進(jìn)行冷凍干燥即為純化所得抗腫瘤蛋白(組分Ⅵ)。每1kg新鮮活蟲材料大約可得到電泳純的抗腫瘤蛋白56mg,蛋白得率0.0056%。 活性組分Ⅵ在SDS-PAGE上顯示為單一條帶,表觀分子質(zhì)量約為72kDa,表明其達(dá)到了電泳純;MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)果表明其分子質(zhì)量為71.737kDa,與SDS-PAGE結(jié)果基本吻合,說明純化得到的抗腫瘤蛋白為單鏈蛋白,分子量約為72kDa,故命名為EPS72。 2EPS72體外抗腫瘤活性研究 MTT存活分析表明EPS72對肝癌Bel-7402細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞等多種人癌細(xì)胞株表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖抑制作用。接著以A549細(xì)胞作為體外腫瘤模型,研究了EPS72對細(xì)胞形態(tài)、凋亡、粘附、伸展、遷移以及侵襲的影響。相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究、臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)、AO/EB染色以及JC-1檢測細(xì)胞膜電位(△Ψm)結(jié)果表明,EPS72作用早期可誘導(dǎo)已貼壁生長的腫瘤細(xì)胞脫粘附,但是剛脫粘附細(xì)胞為胞膜完整的活細(xì)胞,撤藥后能正常生長,而脫粘附細(xì)胞持續(xù)受藥物作用后則會進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡性死亡�？梢�,EPS72誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞脫粘附的作用是直接的,而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用是間接的。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,EPS72能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞向細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白成分纖粘連蛋白(fibronectin,FN)和Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ,Col Ⅳ)的粘附,但對細(xì)胞向非ECM成分多聚賴氨酸(poly-L-lysine, PL)的粘附卻沒有影響。癌細(xì)胞體外伸展實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,EPS72能夠抑制腫瘤細(xì)胞在ECM表面上伸展。創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)表明EPS72能夠阻止腫瘤細(xì)胞向創(chuàng)傷面遷移。Transwell實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明EPS72能夠影響腫瘤細(xì)胞向Matrigel的侵襲能力�？梢�,EPS72通過影響腫瘤細(xì)胞的粘附、伸展、轉(zhuǎn)移、侵襲及增殖、存活能力發(fā)揮體外抗腫瘤作用,EPS72具有體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。 3EPS72體外抗腫瘤作用的分子機(jī)制 為了進(jìn)一步探討EPS72體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,利用熒光顯微鏡采用免疫熒光法研究了EPS72對細(xì)胞肌動蛋白骨架成分F-actin的影響；采用流式細(xì)胞儀和Western blotting技術(shù)研究了EPS72作用后腫瘤細(xì)胞β1-整合素和整合素關(guān)聯(lián)蛋白激酶(ILK)表達(dá)情況。結(jié)果表明,EPS72作用后F-actin的聚合受到抑制,腫瘤細(xì)胞p1-整合素和ILK的表達(dá)受到抑制,推測EPS72可能通過直接靶向腫瘤細(xì)胞表面的β1-整合素,進(jìn)而影響整合素—細(xì)胞骨架信號通路發(fā)揮體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。 本研究取得的成果和結(jié)論主要有： (1)采用現(xiàn)代生化分離技術(shù),首次從中華真地鱉新鮮雌蟲體中分離純化得到一種分子量約為72kDa的抗腫瘤蛋白,命名為EPS72。該分離純化工藝條件溫和,操作簡單,并易于規(guī)�；糯笊a(chǎn)。 (2)體外研究表明,EPS72對人肝癌Bel-7402細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞等人癌細(xì)胞株表現(xiàn)出較強(qiáng)的胞毒活性,而對非癌細(xì)胞株MRC5的細(xì)胞毒性較低,顯示該活性蛋白具有較強(qiáng)的廣譜抗腫瘤活性,且對腫瘤細(xì)胞顯示出良好的選擇性。 (3)確定了EPS72通過影響腫瘤細(xì)胞的粘附、伸展、轉(zhuǎn)移、侵襲及增殖、存活能力發(fā)揮體外抗腫瘤作用,EPS72具有體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力。 (4)初步推測EPS72可能通過直接靶向腫瘤細(xì)胞表面的β1-整合素,進(jìn)而影響整合素—細(xì)胞骨架信號通路發(fā)揮體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。
【關(guān)鍵詞】：中華真地鱉 抗腫瘤蛋白 分離純化 抗腫瘤轉(zhuǎn)移 分子機(jī)制 β1-整合素 人肺癌細(xì)胞株A549
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R284.2;R285
【目錄】：

• 中文摘要16-19
• ABSTRACT19-23
• 符號說明23-25
• 第一章 前言25-48
• 1 抗腫瘤藥物研發(fā)戰(zhàn)略25-28
• 1.1 新的細(xì)胞毒類藥物25-27
• 1.2 新靶點(diǎn)抗腫瘤藥物研究27-28
• 2 整合素與腫瘤轉(zhuǎn)移28-37
• 2.1 整合素結(jié)構(gòu)28-30
• 2.2 整合素在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用30-37
• 2.2.1 整合素對細(xì)胞存活的作用32
• 2.2.2 整合素對細(xì)胞遷移的影響32-33
• 2.2.3 整合素調(diào)節(jié)血管生成33-34
• 2.2.4 整合素對腫瘤入侵與轉(zhuǎn)移的影響34
• 2.2.5 ECM—整合素相互作用成為癌癥治療的重要靶點(diǎn)34-37
• 2.2.5.1 整合素抑制劑34-36
• 2.2.5.2 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)抑制劑36-37
• 3 動物毒素的抗腫瘤作用37-40
• 3.1 斑蝥素(cantharidin,CA)37
• 3.2 多肽、蛋白質(zhì)或酶類37-40
• 3.2.1 蛇毒素去整合素(Disintegrins)38
• 3.2.2 蝎毒素Chlorotoxin(Cltx)38-39
• 3.2.3 蜂毒素(Melittin)39
• 3.2.4 海鞘多肽Didemnin B39-40
• 3.2.5 海兔多肽Dolastatin40
• 3.2.6 海兔蛋白Cyplasin40
• 4 中華真地鱉化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展40-46
• 4.1 中華真地鱉活性成分41-43
• 4.1.1 蛋白質(zhì)(酶)和氨基酸41-42
• 4.1.1.1 氨基酸41-42
• 4.1.1.2 纖溶活性成分42
• 4.1.1.3 抗腫瘤活性蛋白成分42
• 4.1.2 脂肪酸42-43
• 4.1.3 生物堿43
• 4.1.4 脂溶性維生素和無機(jī)元素43
• 4.1.5 高級醇及其衍生物43
• 4.1.6 其他成分43
• 4.2 中華真地鱉的藥理作用43-46
• 4.2.1 對心血管系統(tǒng)的影響44-45
• 4.2.1.1 抗凝血和抗血栓作用44
• 4.2.1.2 調(diào)節(jié)血脂、抗氧自由基及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用44
• 4.2.1.3 對血液流變性作用44-45
• 4.2.1.4 抗缺血缺氧45
• 4.2.2 抑制血管生成及抗腫瘤活性45
• 4.2.3 抗突變作用45-46
• 4.2.4 治療骨折創(chuàng)傷作用46
• 4.2.5 對免疫系統(tǒng)的影響及抗氧化作用46
• 4.2.6 其他作用46
• 5 本課題研究的目的和意義46-48
• 第二章 中華真地鱉抗腫瘤蛋白分離純化及鑒定48-72
• 1 材料48-51
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料及細(xì)胞48-49
• 1.2 主要儀器設(shè)備及耗材49-50
• 1.3 酶及主要試劑50-51
• 2 實(shí)驗(yàn)方法51-60
• 2.1 中華真地鱉抗腫瘤蛋白的分離純化51-55
• 2.1.1 蛋白粗提物的制備51
• 2.1.2 抗腫瘤蛋白的純化51-54
• 2.1.2.1 CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜51-52
• 2.1.2.2 DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換色譜52-53
• 2.1.2.3 Q-Sepharose HP強(qiáng)陰離子交換色譜53
• 2.1.2.4 Butyl Sepharose HP疏水相互作用色譜53-54
• 2.1.2.5 Superdex 75凝膠過濾色譜54
• 2.1.3 中華真地鱉抗腫瘤蛋白提取純化流程54-55
• 2.2 BCA法測定蛋白濃度55-56
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)56-57
• 2.4 MTT法檢測蛋白組分體外抗腫瘤活性57-58
• 2.5 中華真地鱉抗腫瘤蛋白鑒定58-60
• 2.5.1 SDS-PAGE鑒定蛋白純度和表觀分子量58-60
• 2.5.2 質(zhì)譜法測定分子質(zhì)量60
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理60
• 3 結(jié)果60-67
• 3.1 中華真地鱉抗腫瘤蛋白的分離純化60-65
• 3.1.1 CM-Sepharose FF陽離子交換色譜結(jié)果60-61
• 3.1.2 DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜結(jié)果61-62
• 3.1.3 Q-Sepharose HP陰離子交換色譜結(jié)果62-63
• 3.1.4 Butyl SepharoseHP疏水色譜結(jié)果63-64
• 3.1.5 Superdex 75凝膠過濾色譜結(jié)果64-65
• 3.2 中華真地鱉抗腫瘤蛋白鑒定65-66
• 3.2.1 SDS-PAGE結(jié)果65
• 3.2.2 MALDI-TOF-MS結(jié)果65-66
• 3.3 中華真地鱉抗腫瘤蛋白得率66
• 3.4 分離純化過程中各活性組分體外抗腫瘤活性檢測66-67
• 4 討論67-71
• 5 本章小結(jié)71-72
• 第三章 中華真地鱉抗腫瘤蛋白EPS72體外抗腫瘤方式研究72-96
• 1 材料72-74
• 1.1 細(xì)胞系72
• 1.2 主要儀器設(shè)備及耗材72-73
• 1.3 酶及主要試劑73-74
• 1.4 主要試劑的配制74
• 2 實(shí)驗(yàn)方法74-81
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)74
• 2.2 MTT存活分析74-75
• 2.2.1 EPS72抗瘤譜分析75
• 2.2.2 EPS72對A549細(xì)胞增殖的影響75
• 2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察75
• 2.4 臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)75-76
• 2.5 JC-1檢測線粒體膜電位(△Ψm)76-77
• 2.6 AO/EB雙熒光染色77-78
• 2.7 細(xì)胞—基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)78-79
• 2.8 細(xì)胞伸展實(shí)驗(yàn)79-80
• 2.9 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)80
• 2.10 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)80-81
• 2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理81
• 3 結(jié)果81-93
• 3.1 EPS72對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的胞毒作用81-83
• 3.2 EPS72對A549細(xì)胞增殖與存活的影響83-84
• 3.3 EPS72對A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響84-85
• 3.4 脫粘附細(xì)胞存活狀態(tài)檢測85-86
• 3.4.1 臺盼藍(lán)染色結(jié)果85-86
• 3.4.2 撤藥重培養(yǎng)結(jié)果86
• 3.5 EPS72進(jìn)一步誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡86-89
• 3.5.1 JC-1檢測線粒體膜電位(△Ψm)結(jié)果86-88
• 3.5.2 AO/EB熒光染色結(jié)果88-89
• 3.6 EPS72對A549細(xì)胞粘附的影響89-90
• 3.7 EPS72對A549細(xì)胞伸展能力的影響90-92
• 3.8 EPS72對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響92
• 3.9 EPS72對腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響92-93
• 4 討論93-95
• 5 本章小結(jié)95-96
• 第四章 中華真地鱉抗腫瘤蛋白EPS72體外抗腫瘤作用分子機(jī)制的初步研究96-110
• 1 材料96-98
• 1.1 細(xì)胞系96
• 1.2 主要儀器設(shè)備及耗材96-97
• 1.3 酶及主要試劑97-98
• 2 實(shí)驗(yàn)方法98-104
• 2.1 微絲F-actin免疫熒光染色98-99
• 2.2 流式細(xì)胞儀檢測β1-整合素的表面表達(dá)99
• 2.3 Western blotting分析β1-整合素和ILK細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況99-104
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析104
• 3 結(jié)果104-107
• 3.1 EPS72誘導(dǎo)F-actin解聚104-105
• 3.2 EPS72影響β1-整合素和ILK表達(dá)105-107
• 4 討論107-109
• 5 本章小結(jié)109-110
• 總結(jié)與展望110-112
• 1 本研究的主要結(jié)論110
• 2 展望110-112
• 參考文獻(xiàn)112-128
• Article128-136
• 致謝136-137
• 博士期間發(fā)表的論文137-138
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表138

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李興暖;韓雅莉;;地鱉蟲纖溶活性蛋白組分抑制血管的生成[J];動物學(xué)報(bào);2007年01期

2 黃金保，馮改壯，，劉驍駟，范毅敏，宋曉亮;土鱉蟲抗兔心腦缺氧實(shí)驗(yàn)研究[J];長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1994年02期

3 徐成鋼,梅長林,趙海丹;土鱉蟲水煎劑對人多囊腎病囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖的影響[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年02期

4 王淑敏,趙學(xué)良,王本祥,周秋麗,劉忠英,安汝國,劉志強(qiáng),劉淑瑩;中藥土鱉蟲溶栓成分的分離純化研究[J];分析化學(xué);2005年10期

5 張勤;酶法制取土鱉蟲氨基酸口服液的研究[J];廣州食品工業(yè)科技;1998年03期

6 賀衛(wèi)和,成細(xì)華,徐愛良;土鱉蟲提取液對家兔抗凝血作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年02期

7 唐慶峰;吳振廷;金濤;王學(xué)林;吳尚澧;;地鱉蟲活性物質(zhì)的超臨界CO_2萃取及其藥效[J];昆蟲知識;2006年03期

8 于燕,劉繼蘭,王菊英,劉玉娥,劉萍;土鱉蟲水提液對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[J];山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2002年05期

9 韓雅莉;李張偉;;地鱉纖溶活性蛋白的純化及性質(zhì)研究[J];生物工程學(xué)報(bào);2006年04期

10 于燕,劉繼蘭,王菊英,劉玉娥,劉萍;土鱉蟲水提物對實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮和內(nèi)皮素的影響[J];中國生化藥物雜志;2003年01期

  本文關(guān)鍵詞：中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis）抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉(zhuǎn)移活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：260428