本文關鍵詞：中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis）抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉移活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis Walker),俗稱土鱉、土元等,屬于蜚蠊目(Blattodea),鱉蠊科(Corydiidae),地鱉亞科(Polyphaginae),真地鱉屬(Eupolyphaga)昆蟲,目前已實現大規(guī)模人工養(yǎng)殖。中華真地鱉作為一種傳統(tǒng)中藥,在我國具有悠久的藥用歷史。現代研究表明,中華真地鱉具有溶解血栓、抗凝血、抗腫瘤、促進骨折愈合、調節(jié)血脂等十分廣泛的藥理作用。對于中華真地鱉的研究,國外學者很少涉及,其研究近乎空白。近年來,國內學者研究表明中華真地鱉蛋白提取物能夠抑制血管生成和腫瘤生長�？梢�,蛋白組分被認為是中華真地鱉的抗腫瘤有效組分。但是,到目前為止,尚未見中華真地鱉抗腫瘤蛋白成分的報導。 我們利用現代生化分離技術,從中華真地鱉新鮮雌蟲體中分離純化得到一分子質量約為72kDa的抗腫瘤蛋白,命名為EPS72。該蛋白對人肝癌細胞株Bel-7402、肺癌細胞株A549等多種人癌細胞株表現出較強的增殖抑制作用。以A549細胞作為體外腫瘤模型,研究了EPS72對細胞形態(tài)、增殖、凋亡、粘附、伸展、遷移以及侵襲的影響,發(fā)現EPS72具有體外抗腫瘤轉移活性,并初步探討了EPS72體外抗腫瘤轉移可能的分子機制。期望為EPS72進一步開發(fā)利用提供一定的線索,同時為抗腫瘤蛋白類藥物的研究提供一些新的思路。本課題的主要研究內容及結果有以下幾個方面： 1中華真地鱉抗腫瘤蛋白的提取、純化及鑒定 首先采用硫酸銨分級沉淀(50%-80%飽和度)、超濾(截留分子質量為10kDa)和冷凍干燥技術獲得蛋白粗提物(組分Ⅰ)。由組分Ⅰ得到抗腫瘤活性蛋白的純化方案由捕獲、中度純化和精制三個步驟組成：(1)捕獲：分別采用CM-Sepharose FF陽離子交換色譜和DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜對抗腫瘤有效活性組分進行捕獲；(2)中度純化：分別采用Q-Sepharose HP陰離子交換色譜和Butyl Sepharose HP疏水色譜進行中度純化；(3)精制：采用Superdex75凝膠過濾色譜進行精制。整個純化過程中采用280nm檢測蛋白質洗脫情況,分別收集各洗脫峰,采用MTT法追蹤抗腫瘤活性組分,最后得到的活性組分進行冷凍干燥即為純化所得抗腫瘤蛋白(組分Ⅵ)。每1kg新鮮活蟲材料大約可得到電泳純的抗腫瘤蛋白56mg,蛋白得率0.0056%。 活性組分Ⅵ在SDS-PAGE上顯示為單一條帶,表觀分子質量約為72kDa,表明其達到了電泳純;MALDI-TOF質譜結果表明其分子質量為71.737kDa,與SDS-PAGE結果基本吻合,說明純化得到的抗腫瘤蛋白為單鏈蛋白,分子量約為72kDa,故命名為EPS72。 2EPS72體外抗腫瘤活性研究 MTT存活分析表明EPS72對肝癌Bel-7402細胞、肺癌A549細胞等多種人癌細胞株表現出較強的增殖抑制作用。接著以A549細胞作為體外腫瘤模型,研究了EPS72對細胞形態(tài)、凋亡、粘附、伸展、遷移以及侵襲的影響。相差顯微鏡下細胞形態(tài)學研究、臺盼藍染色計數、AO/EB染色以及JC-1檢測細胞膜電位(△Ψm)結果表明,EPS72作用早期可誘導已貼壁生長的腫瘤細胞脫粘附,但是剛脫粘附細胞為胞膜完整的活細胞,撤藥后能正常生長,而脫粘附細胞持續(xù)受藥物作用后則會進一步誘導細胞凋亡性死亡�？梢�,EPS72誘導腫瘤細胞脫粘附的作用是直接的,而誘導細胞凋亡的作用是間接的。細胞粘附實驗進一步表明,EPS72能夠顯著抑制腫瘤細胞向細胞外基質(ECM)蛋白成分纖粘連蛋白(fibronectin,FN)和Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ,Col Ⅳ)的粘附,但對細胞向非ECM成分多聚賴氨酸(poly-L-lysine, PL)的粘附卻沒有影響。癌細胞體外伸展實驗結果表明,EPS72能夠抑制腫瘤細胞在ECM表面上伸展。創(chuàng)傷愈合實驗表明EPS72能夠阻止腫瘤細胞向創(chuàng)傷面遷移。Transwell實驗進一步證明EPS72能夠影響腫瘤細胞向Matrigel的侵襲能力�？梢�,EPS72通過影響腫瘤細胞的粘附、伸展、轉移、侵襲及增殖、存活能力發(fā)揮體外抗腫瘤作用,EPS72具有體外抗腫瘤轉移活性。 3EPS72體外抗腫瘤作用的分子機制 為了進一步探討EPS72體外抗腫瘤轉移的分子機制,利用熒光顯微鏡采用免疫熒光法研究了EPS72對細胞肌動蛋白骨架成分F-actin的影響；采用流式細胞儀和Western blotting技術研究了EPS72作用后腫瘤細胞β1-整合素和整合素關聯蛋白激酶(ILK)表達情況。結果表明,EPS72作用后F-actin的聚合受到抑制,腫瘤細胞p1-整合素和ILK的表達受到抑制,推測EPS72可能通過直接靶向腫瘤細胞表面的β1-整合素,進而影響整合素—細胞骨架信號通路發(fā)揮體外抗腫瘤轉移作用。 本研究取得的成果和結論主要有： (1)采用現代生化分離技術,首次從中華真地鱉新鮮雌蟲體中分離純化得到一種分子量約為72kDa的抗腫瘤蛋白,命名為EPS72。該分離純化工藝條件溫和,操作簡單,并易于規(guī)�；糯笊a。 (2)體外研究表明,EPS72對人肝癌Bel-7402細胞、肺癌A549細胞等人癌細胞株表現出較強的胞毒活性,而對非癌細胞株MRC5的細胞毒性較低,顯示該活性蛋白具有較強的廣譜抗腫瘤活性,且對腫瘤細胞顯示出良好的選擇性。 (3)確定了EPS72通過影響腫瘤細胞的粘附、伸展、轉移、侵襲及增殖、存活能力發(fā)揮體外抗腫瘤作用,EPS72具有體外抗腫瘤轉移能力。 (4)初步推測EPS72可能通過直接靶向腫瘤細胞表面的β1-整合素,進而影響整合素—細胞骨架信號通路發(fā)揮體外抗腫瘤轉移作用。
【關鍵詞】：中華真地鱉 抗腫瘤蛋白 分離純化 抗腫瘤轉移 分子機制 β1-整合素 人肺癌細胞株A549
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R284.2;R285
【目錄】：

• 中文摘要16-19
• ABSTRACT19-23
• 符號說明23-25
• 第一章 前言25-48
• 1 抗腫瘤藥物研發(fā)戰(zhàn)略25-28
• 1.1 新的細胞毒類藥物25-27
• 1.2 新靶點抗腫瘤藥物研究27-28
• 2 整合素與腫瘤轉移28-37
• 2.1 整合素結構28-30
• 2.2 整合素在腫瘤轉移過程中的作用30-37
• 2.2.1 整合素對細胞存活的作用32
• 2.2.2 整合素對細胞遷移的影響32-33
• 2.2.3 整合素調節(jié)血管生成33-34
• 2.2.4 整合素對腫瘤入侵與轉移的影響34
• 2.2.5 ECM—整合素相互作用成為癌癥治療的重要靶點34-37
• 2.2.5.1 整合素抑制劑34-36
• 2.2.5.2 基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑36-37
• 3 動物毒素的抗腫瘤作用37-40
• 3.1 斑蝥素(cantharidin,CA)37
• 3.2 多肽、蛋白質或酶類37-40
• 3.2.1 蛇毒素去整合素(Disintegrins)38
• 3.2.2 蝎毒素Chlorotoxin(Cltx)38-39
• 3.2.3 蜂毒素(Melittin)39
• 3.2.4 海鞘多肽Didemnin B39-40
• 3.2.5 海兔多肽Dolastatin40
• 3.2.6 海兔蛋白Cyplasin40
• 4 中華真地鱉化學成分及藥理作用研究進展40-46
• 4.1 中華真地鱉活性成分41-43
• 4.1.1 蛋白質(酶)和氨基酸41-42
• 4.1.1.1 氨基酸41-42
• 4.1.1.2 纖溶活性成分42
• 4.1.1.3 抗腫瘤活性蛋白成分42
• 4.1.2 脂肪酸42-43
• 4.1.3 生物堿43
• 4.1.4 脂溶性維生素和無機元素43
• 4.1.5 高級醇及其衍生物43
• 4.1.6 其他成分43
• 4.2 中華真地鱉的藥理作用43-46
• 4.2.1 對心血管系統(tǒng)的影響44-45
• 4.2.1.1 抗凝血和抗血栓作用44
• 4.2.1.2 調節(jié)血脂、抗氧自由基及保護血管內皮細胞的作用44
• 4.2.1.3 對血液流變性作用44-45
• 4.2.1.4 抗缺血缺氧45
• 4.2.2 抑制血管生成及抗腫瘤活性45
• 4.2.3 抗突變作用45-46
• 4.2.4 治療骨折創(chuàng)傷作用46
• 4.2.5 對免疫系統(tǒng)的影響及抗氧化作用46
• 4.2.6 其他作用46
• 5 本課題研究的目的和意義46-48
• 第二章 中華真地鱉抗腫瘤蛋白分離純化及鑒定48-72
• 1 材料48-51
• 1.1 實驗材料及細胞48-49
• 1.2 主要儀器設備及耗材49-50
• 1.3 酶及主要試劑50-51
• 2 實驗方法51-60
• 2.1 中華真地鱉抗腫瘤蛋白的分離純化51-55
• 2.1.1 蛋白粗提物的制備51
• 2.1.2 抗腫瘤蛋白的純化51-54
• 2.1.2.1 CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜51-52
• 2.1.2.2 DEAE-Sepharose FF弱陰離子交換色譜52-53
• 2.1.2.3 Q-Sepharose HP強陰離子交換色譜53
• 2.1.2.4 Butyl Sepharose HP疏水相互作用色譜53-54
• 2.1.2.5 Superdex 75凝膠過濾色譜54
• 2.1.3 中華真地鱉抗腫瘤蛋白提取純化流程54-55
• 2.2 BCA法測定蛋白濃度55-56
• 2.3 細胞培養(yǎng)56-57
• 2.4 MTT法檢測蛋白組分體外抗腫瘤活性57-58
• 2.5 中華真地鱉抗腫瘤蛋白鑒定58-60
• 2.5.1 SDS-PAGE鑒定蛋白純度和表觀分子量58-60
• 2.5.2 質譜法測定分子質量60
• 2.6 統(tǒng)計學處理60
• 3 結果60-67
• 3.1 中華真地鱉抗腫瘤蛋白的分離純化60-65
• 3.1.1 CM-Sepharose FF陽離子交換色譜結果60-61
• 3.1.2 DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜結果61-62
• 3.1.3 Q-Sepharose HP陰離子交換色譜結果62-63
• 3.1.4 Butyl SepharoseHP疏水色譜結果63-64
• 3.1.5 Superdex 75凝膠過濾色譜結果64-65
• 3.2 中華真地鱉抗腫瘤蛋白鑒定65-66
• 3.2.1 SDS-PAGE結果65
• 3.2.2 MALDI-TOF-MS結果65-66
• 3.3 中華真地鱉抗腫瘤蛋白得率66
• 3.4 分離純化過程中各活性組分體外抗腫瘤活性檢測66-67
• 4 討論67-71
• 5 本章小結71-72
• 第三章 中華真地鱉抗腫瘤蛋白EPS72體外抗腫瘤方式研究72-96
• 1 材料72-74
• 1.1 細胞系72
• 1.2 主要儀器設備及耗材72-73
• 1.3 酶及主要試劑73-74
• 1.4 主要試劑的配制74
• 2 實驗方法74-81
• 2.1 細胞培養(yǎng)74
• 2.2 MTT存活分析74-75
• 2.2.1 EPS72抗瘤譜分析75
• 2.2.2 EPS72對A549細胞增殖的影響75
• 2.3 細胞形態(tài)學觀察75
• 2.4 臺盼藍染色計數75-76
• 2.5 JC-1檢測線粒體膜電位(△Ψm)76-77
• 2.6 AO/EB雙熒光染色77-78
• 2.7 細胞—基質粘附實驗78-79
• 2.8 細胞伸展實驗79-80
• 2.9 細胞遷移實驗80
• 2.10 細胞侵襲實驗80-81
• 2.11 統(tǒng)計學處理81
• 3 結果81-93
• 3.1 EPS72對體外培養(yǎng)腫瘤細胞及正常細胞的胞毒作用81-83
• 3.2 EPS72對A549細胞增殖與存活的影響83-84
• 3.3 EPS72對A549細胞形態(tài)學的影響84-85
• 3.4 脫粘附細胞存活狀態(tài)檢測85-86
• 3.4.1 臺盼藍染色結果85-86
• 3.4.2 撤藥重培養(yǎng)結果86
• 3.5 EPS72進一步誘導A549細胞凋亡86-89
• 3.5.1 JC-1檢測線粒體膜電位(△Ψm)結果86-88
• 3.5.2 AO/EB熒光染色結果88-89
• 3.6 EPS72對A549細胞粘附的影響89-90
• 3.7 EPS72對A549細胞伸展能力的影響90-92
• 3.8 EPS72對腫瘤細胞遷移能力的影響92
• 3.9 EPS72對腫瘤細胞侵襲能力的影響92-93
• 4 討論93-95
• 5 本章小結95-96
• 第四章 中華真地鱉抗腫瘤蛋白EPS72體外抗腫瘤作用分子機制的初步研究96-110
• 1 材料96-98
• 1.1 細胞系96
• 1.2 主要儀器設備及耗材96-97
• 1.3 酶及主要試劑97-98
• 2 實驗方法98-104
• 2.1 微絲F-actin免疫熒光染色98-99
• 2.2 流式細胞儀檢測β1-整合素的表面表達99
• 2.3 Western blotting分析β1-整合素和ILK細胞內表達情況99-104
• 2.4 統(tǒng)計學分析104
• 3 結果104-107
• 3.1 EPS72誘導F-actin解聚104-105
• 3.2 EPS72影響β1-整合素和ILK表達105-107
• 4 討論107-109
• 5 本章小結109-110
• 總結與展望110-112
• 1 本研究的主要結論110
• 2 展望110-112
• 參考文獻112-128
• Article128-136
• 致謝136-137
• 博士期間發(fā)表的論文137-138
• 學位論文評閱及答辯情況表138

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 李興暖;韓雅莉;;地鱉蟲纖溶活性蛋白組分抑制血管的生成[J];動物學報;2007年01期

2 黃金保，馮改壯，，劉驍駟，范毅敏，宋曉亮;土鱉蟲抗兔心腦缺氧實驗研究[J];長治醫(yī)學院學報;1994年02期

3 徐成鋼,梅長林,趙海丹;土鱉蟲水煎劑對人多囊腎病囊腫襯里上皮細胞增殖的影響[J];第二軍醫(yī)大學學報;2002年02期

4 王淑敏,趙學良,王本祥,周秋麗,劉忠英,安汝國,劉志強,劉淑瑩;中藥土鱉蟲溶栓成分的分離純化研究[J];分析化學;2005年10期

5 張勤;酶法制取土鱉蟲氨基酸口服液的研究[J];廣州食品工業(yè)科技;1998年03期

6 賀衛(wèi)和,成細華,徐愛良;土鱉蟲提取液對家兔抗凝血作用的實驗研究[J];湖南中醫(yī)學院學報;2003年02期

7 唐慶峰;吳振廷;金濤;王學林;吳尚澧;;地鱉蟲活性物質的超臨界CO_2萃取及其藥效[J];昆蟲知識;2006年03期

8 于燕,劉繼蘭,王菊英,劉玉娥,劉萍;土鱉蟲水提液對實驗性高脂血癥大鼠血管內皮細胞的保護作用[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2002年05期

9 韓雅莉;李張偉;;地鱉纖溶活性蛋白的純化及性質研究[J];生物工程學報;2006年04期

10 于燕,劉繼蘭,王菊英,劉玉娥,劉萍;土鱉蟲水提物對實驗性高脂血癥大鼠血管內皮和內皮素的影響[J];中國生化藥物雜志;2003年01期

  本文關鍵詞：中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis）抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉移活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：260428